Альтернатива антибиотикам
Антимикробные пептиды
Алексей Васильченко, кандидат биологических наук, Институт экологической и сельскохозяйственной биологии (X-BIO), Тюменский государственный университет.
Антимикробные пептиды – это защитные молекулы, которые обеспечивают врожденный иммунитет практически всех живых существ. С точки зрения химии пептиды представляют собой последовательность аминокислот определенной длины в цепочке. Это разнообразная группа молекул природного или синтетического происхождения, которые обладают антимикробными свойствами. Они способны взаимодействовать с бактериальными клетками и действовать либо бактерицидно, то есть убивать их, либо бактериостатически – замедлять их физиологию, из-за чего клетки перестают делиться и расти.
Антимикробные пептиды продуцируются практически всеми живыми организмами. Это эволюционно-древний способ защиты организмов от окружающего воздействия бактерий-патогенов, средство врожденного иммунитета: начиная с зародыша эти молекулы защищают организм. У позвоночных организмов есть приобретенный иммунитет – антитела, которые вырабатываются, если организм переболеет инфекцией, а есть врожденные антимикробные пептиды: в комплекте с телом идет средство защиты от бактерий, вирусов и паразитов.
Классификация антимикробных пептидов
Антимикробные пептиды сложно классифицировать исходя из их структурного разнообразия. База данных по антимикробным пептидам (на октябрь 2018 года) содержит сведения о трех тысячах пептидов. Туда входят пептиды животных, растений и бактерий.
Есть два пути природного синтеза пептидов: рибосомальный синтез и нерибосомный синтез. Синтезированные посредством рибосом пептиды вырабатываются практически всеми организмами. Их классификация основана на вторичной структуре, которую молекулы образуют в водных растворах. Различают α-спиральные пептиды, пептиды с β-складчатой структурой и с неупорядоченной (случайной) структурой.
Еще более разнообразны антимикробные пептиды, синтезируемые микроорганизмами: микроорганизмы способны не только нерибосомально синтезировать, но и затем модифицировать синтезированные на рибосомах молекулы. Посттрансляционные модификации придают пептидам дополнительные свойства. Например, они лучше распознают мишени и более стабильны, а поэтому и более функциональны по сравнению с рибосомально синтезированными пептидами животных.
Пептиды как альтернатива классическим антибиотикам
Антимикробные пептиды уже не один десяток лет рассматривают как альтернативу конвенциональным антибиотикам, которые применяются в терапии инфекционных заболеваний. Антибиотики сейчас перестают работать, в некоторых случаях помогают только антибиотики «последней надежды»: когда выбор между тем, умрет пациент от сепсиса или у него откажут почки от антибиотиков, назначают антибиотики последней надежды.
Антимикробные пептиды обладают уникальной способностью преодолевать вирулентность и устойчивость бактерий за счет воздействия на самые консервативные структуры микробной клетки. Антимикробные пептиды менее токсичны, чем классические антибиотики, и разлагаются в организме человека очень быстро. Но с этим связан и тот факт, почему пептиды до сих пор не используют широко: они слишком быстро выводятся из организма. Вводить их внутривенно неэффективно: пептиды далеко не уйдут по кровотоку. И через желудочно-кишечный тракт назначать их бессмысленно, поскольку в желудке они расщепятся. На данный момент одобренных и прошедших клиническую апробацию препаратов на основе антимикробных пептидов не так много, и стоят они очень дорого.
Антимикробные пептиды применяются не только в медицине. Например, антимикробный пептид бактериального происхождения низин уже более 50 лет используется в пищевой промышленности. В составе продуктов можно встретить добавку Е-234 – это низин. Этот пептид действует на патогенную флору, которая вызывает порчу продуктов, например на листерии – это возбудители смертельных заболеваний животных и человека, которые передаются в основном с пищей.
Еще одно положительное свойство антимикробных пептидов и причина, почему их не исключают как альтернативу классическим антибиотикам, в том, что пептиды действуют на бактерии, угнетают их, при этом резистентность к ним хоть и вырабатывается, но не так часто, как в случае обычных антибиотиков.
Резистентность к антибиотикам
Бактерии формируют устойчивость к классическим антибиотикам благодаря переносу генов. Бактерия способна заменить одну аминокислоту на другую в рибосоме, и антибиотики, связанные с рибосомой, перестают действовать. Антимикробные пептиды действуют на такие структуры бактериальных клеток, которые бактериям очень сложно заменить. Например, пептиды действуют на бактериальную стенку, а поменять целиком строение стенки не получится ни у одной бактерии.
Антимикробные пептиды внедряются в клеточную стенку и создают в ней поры, из которых вытекает внутриклеточное содержимое бактерии. В некоторых случаях мембрана разрывается на куски, а клетка разваливается. Пептиды работают очень быстро: если обычному антибиотику требуются часы, чтобы подействовать, то пептид разрушает бактериальную клетку в считаные секунды. Чем быстрее препарат подействует на клетку, тем меньше шансов, что клетка начнет делиться и образовывать устойчивые формы.
Резистентность к антимикробным пептидам тоже возникает, но гораздо реже, чем к конвенциональным антибиотикам.
Субингибиторный эффект
В естественных условиях, а не в пробирке, концентрация пептидов, необходимая для уничтожения микроорганизмов, не всегда достижима по разным причинам, включая элементарное разбавление в окружающей влаге. Что будет, если не подобрать достаточную концентрацию, которая будет убивать клетки? Что будет происходить с бактериальной клеткой, на которую подействует низкая концентрация вещества? Эффекты могут быть разными – как негативными, так и позитивными для человека.
Клетка может отреагировать так, что станет более агрессивной и превратится в «супермонстра», а может получиться позитивный эффект: клетка перестанет выделять токсины, но при этом не умрет. От чего зависит тот или иной сценарий?
Молекулы пептидов, как правило, положительно заряжены, поэтому они электростатически взаимодействуют с клеточной стенкой бактерии, которая заряжена отрицательно. Мембранные структуры, отделяющие клеточное содержимое от окружающей среды, имеют множество сенсоров: как у человека нервные окончания на коже, так и у бактерий в мембранных структурах есть сенсоры. Подобная система состоит из сенсорного белка (гистидинкиназы) и соответствующего ему регулятора ответа. Сенсорная киназа изнутри прикрепляется к бактериальной цитоплазматической мембране и имеет чувствительный хвост на ее наружной стороне. Большинство антимикробных пептидов заряжено положительно, и это позволяет им напрямую взаимодействовать с этим участком сенсора, что приводит к активации сигнальной системы.
Если клетка не погибла сразу при воздействии пептидов, сенсоры взаимодействуют с пептидами и начинают передавать сигнал на генный аппарат, который реагирует на эти специфические сигналы. Например, он может поменять клеточные стенки в наружной мембране: заменить одну молекулу другой и повысить заряд. Пептид заряжен положительно, клеточная стенка заряжена отрицательно, значит, нужно сделать заряд мембраны положительным, и одноименно заряженные молекулы будут отталкиваться, как магниты. Могут начать работать «насосы», которые будут откачивать пептиды из клетки наружу, либо продукты будут выделяться из протеолитических ферментов и расщеплять угрожающие клетке пептиды.
На одни пептиды сенсоры мембраны бактерий реагируют, а на другие нет. Есть подозрение, что существует определенная специфичность и клетки могут распознавать, какой перед ними пептид. Пока нет четкого математического статистического описания этого процесса, и нельзя с уверенностью сказать, будет на конкретную молекулу реакция или нет.
Субингибиторный эффект относительно лучше изучен в случае конвенциональных антибиотиков, которые выпускаются в виде фармпрепаратов, – их действие в субингибирующих концентрациях изучается достаточно давно. Уже хорошо известно, что малые концентрации антибиотиков могут вызывать неожиданные реакции со стороны бактериальной популяции. Например, фторхинолоны могут стимулировать бактериальную адаптацию к различным стрессам, включая действие самих антибиотиков, а пенициллины – усиливать образование биопленок.
Пептиды широкого и узкого спектра действия
Антимикробные пептиды животных обладают широким спектром действия: пептиды в кожном секрете шпорцевой лягушки действуют практически на все виды бактерий – и на грамположительные, и на грамотрицательные.
Грамположительные и грамотрицательные бактерии различаются строением клеточной стенки: благодаря более мощной и непроницаемой клеточной стенке грамотрицательные бактерии более устойчивы, чем грамположительные. Например, антибиотик пенициллин замедляет рост клеточной стенки и на грамположительные бактерии действует лучше, чем на грамотрицательные. Кроме того, есть клетки, у которых нет наружной мембраны, а есть клетки, у которых есть наружная мембрана, действующая как дополнительный барьер против пептидов – антимикробные пептиды широкого спектра действуют на все эти типы клеток.
Бактериоцины – это антимикробные пептиды, продуцируемые бактериями. От пептидов, которые продуцирует лягушка, их отличает то, что пептиды бактерий действуют только на представителей своего рода: пептиды, продуцируемые энтерококком, будут уничтожать только энтерококки.
При проведении терапии стоит действовать избирательно на определенную группу бактерий, чтобы у человека не погибла вся микрофлора. Для этого можно создавать комбинированные препараты на основе пептидов узкого и широкого спектра действия.
Получение пептидов
Антимикробные пептиды получают путем химического синтеза, но существуют ограничения, связанные с длиной пептида: синтезировать пептид больше чем 30 аминокислотных остатков довольно сложно. Химически синтезированные пептиды невозможно уложить в пространстве в необходимую структуру. Пептиды, синтезируемые живым организмом, имеют определенную кладку, которая играет роль в антимикробных свойствах, и синтезированная молекула будет уступать природному аналогу.
Можно заниматься драг-дизайном и заменять в молекуле одну аминокислоту на другую. При этом меняются физико-химические свойства пептида: ученые добиваются большей антимикробности – требуется меньше вещества, чтобы убить клетки, – и меньшей цитотоксичности – пептид убивает только клетки бактерий и не взаимодействует с эритроцитами. Можно добиться большей устойчивости к действию протеолитических ферментов организма, разрушающих пептиды, благодаря чему можно будет применять пероральное введение пептидов, не боясь их разрушения в желудочно-кишечном тракте. С помощью методов химии можно играть с природными молекулами и улучшать их свойства. В этом подходе тоже есть свои плюсы: мы не можем синтезировать ту молекулу, которую бы нам хотелось, но зато можем модифицировать ее и изменять свойства.
Если знать последовательность аминокислот, можно сконструировать плазмиду: перевести последовательность нуклеотидов в мини-ген и встроить его, например, в кишечную палочку, и кишечная палочка как реактор будет синтезировать пептиды. Это генно-инженерный способ получения веществ – так получают инсулин и много других природных лекарств.
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru