Подписаться на новости
  • Сенатор
  • ООО "Ай Вао"
  • medtech
  • ММИФ-2018
  • Vitacoin

Моноклональные антитела

Как это сделано

Об одном из самых современных и самых перспективных направлений в лечении рака Saint-Petersburg.ru рассказал Тимофей Неманкин, руководитель отдела разработки антител российской биотехнологической корпорации «BIOCAD». Разбирались в сказанном Юрий Строфилов и Анна Киктенко.

Работы, в конечном итоге приведшие к созданию противораковых препаратов на базе моноклональных антител, отмечены восемью Нобелевскими премиями.

У раковой клетки есть одна неприятная особенность – при возникновении заболевания организм не считает ее чужой и поэтому не включает иммунный ответ. Идея состояла в следующем: пометить раковые клетки антителами, чтобы они начали восприниматься как чужеродные и «включали» защитную реакцию организма, которая их уничтожит, как уничтожает ежедневно сотни инфекционных агентов. Красиво, правда? А как вам идея снять розовые очки с клеток иммунной системы и позволить им увидеть чужого среди своих?

В этих случаях практически нет побочных эффектов, поскольку организм самостоятельно справляется с раком и нет никакой необходимости в ковровых бомбардировках химическими препаратами. Оставалось только найти антитела, которые избирательно сцепятся с раковыми клетками и вызовут иммунный ответ.

immunoglobulin.png
Общее строение антител. Fab-фрагмент отвечает за специфичность,
Fc-фрагмент – за эффекторные функции.

Антитела – это специфические белки, каждый из которых связывается с одним определенным антигеном (молекулой-мишенью). Создаваемые в исследовательских лабораториях библиотеки антител состоят из 1012 различных по свойствам белков. Триллион молекул.

Триллион секунд – это пятьсот человеческих жизней подряд, весь жилой фонд России состоит из менее чем триллиона кирпичей, а в океанах нашей планеты плавает около триллиона рыб.

Из этого множества антител нужно отобрать одну молекулу, которая крепко свяжется с раковой клеткой, будет стабильной, и технология ее производства не будет стоить астрономических денег. Пока никакого способа вычислить такую молекулу с нуля нет, все делается методом селекции природных или созданных искусственно (синтетических) библиотек и перебора вариантов. Зато компьютерное моделирование уже активно используется для улучшения найденных вариантов. То есть из всех рыб в океане нам нужно поймать одну особь, отвечающую строжайшим критериям пригодности, и, если это необходимо, создать ее компьютерную модель и просчитать возможные варианты ее улучшения.

1901 г. Эмиль Беринг. Нобелевская премия «за работу по сывороточной терапии».

В начале девяностых годов XIX века в Германии во время эпидемии дифтерии погибли 50 тысяч детей. Эмиль Беринг обнаружил, что в крови переболевших дифтерией присутствуют антитоксины – антитела, нейтрализующие дифтерийный токсин. В рождественскую ночь 1891 года 220 умирающих детей получили сыворотку крови переболевших людей, многие из них были спасены.

Сыворотки, начало разработки которых положил Беринг, называются поликлональными – в них миллионы разных антител, некоторые из которых побеждают болезнь. У таких сывороток есть два существенных недостатка: содержание отдельных антител в поликлональном препарате может варьироваться от одной партии к другой и поликлональные антитела нет возможности применять, если необходимо различить две похожие мишени, то есть они не специфичны. В организме животных каждая из клеток B-лимфоцитов продуцирует антитела только одного вида (является мини-фабрикой по их производству, плавающей в крови). Поэтому задача состоит в том, чтобы выделить антитела, продуцируемые потомками одной клетки. В этом случае мы получим абсолютно идентичные молекулы, называемые моноклональными.

Существует несколько тысяч молекулярных разновидностей рака. Создать и производить тысячи различных моноклональных антител в настоящее время не представляется возможным (за последние 20 лет в мире создано и производится лишь несколько десятков терапевтических антител). А значит, необходимо создавать антитела с наиболее универсальным механизмом действия, эффективно воздействующие на широкий круг заболеваний, но минимально затрагивающие здоровые клетки организма. Поэтому процесс разработки антител начинается с выбора мишеней на раковых клетках или клетках иммунной системы (в случае ультрасовременных иммуноонкологических препаратов) и желаемого механизма их действия. Нам нужно определить, с какими именно видами рака мы будем бороться. После старта проекта по разработке препарата библиотеки антител селектируют (фильтруют) на выбранных мишенях, оставляя миллионы способных присоединяться к мишени белков. Далее из миллионов оставшихся в постселекционной библиотеке антител поштучно анализируют десятки тысяч, отбирая лишь несколько лучших кандидатов на роль терапевтических агентов.

MEGAN LIB – библиотека моноклональных антител

Самая крупная в мире библиотека моноклональных антител создана в корпорации «BIOCAD». Она содержит миллиарды генов различных антител. Библиотека содержит нативные антитела 2000 доноров. Нативные антитела – это белки, полученные от здорового донора-человека, а не от инфицированного животного. Вероятность получения препарата, созданного на основе человеческих антител, выше, чем при применении синтезированных или гуманизированных антител. Выглядит библиотека как маленькая пробирочка с 2 мл жидкости, но она содержит всю мощь иммунной системы человека.

Выглядит поиск молекулы-кандидата так: антитела нарабатывают в бактериальных клетках (используемых в роли мини-фабрик в лабораториях), полученную культуральную жидкость разливают в 96-луночные пластиковые прозрачные планшеты с предварительно закрепленными в лунках молекулами мишени (или клетками-мишенями). После череды реакций в некоторых лунках происходит цветовая реакция. Это значит, что в них обнаружились антитела нужной специфичности, то есть они связывались с мишенью. Антитела из таких лунок многократно нарабатываются и подвергаются дальнейшим тестам. Процесс идет до тех пор, пока антитела не пройдут все необходимые испытания, в ходе которых их отбирают по силе связывания с мишенью, по специфичности (по отсутствию связывания с ненужными мишенями), по способности выполнять необходимые функции и так далее. Так мы получили молекулы – кандидаты на роль терапевтических моноклональных антител. Весь цикл поиска нужных кандидатов занимает несколько месяцев в зависимости от сложности мишени.

1972 год, Родни Портер и Джеральд Эдельман. Нобелевская премия «за открытия, касающиеся химической структуры антител».

С тридцатых годов XX века человечество активно начало изучать структуру и свойства антител. Антитела огромны, в 150 тысяч раз больше атома углерода. Разобраться в их строении, не разобрав молекулу на части, невозможно. И Родни Портер сделал ровно это – расщепил молекулу кроличьего антитела на части. В 1969 году ученые выяснили последовательность всех 1300 аминокислот, образующих белковую цепь. В то время это была самая большая расшифрованная аминокислотная последовательность.

Итак, мы получили нужные молекулы-кандидаты. Теперь необходимо расшифровать их структуру, определить стабильность молекул и оценить технологичность их производства в культурах клеток млекопитающих. Если полученные антитела не удовлетворяют требованиям, создаются их компьютерные модели, и сложная самообучающаяся система предсказывает пути их возможного улучшения. На основе этих вычислительных предсказаний по улучшению кандидатов синтезируются de novo синтетические библиотеки оптимизированных антител, и цикл отбора повторяется.

Когда антитела, наконец, удовлетворяют самым строгим требованиям, их гены внедряют в клетки-продуценты (обычно используют культуру клеток из яичника китайского хомячка). Каждая клетка получает способность производить лишь один вид антител. Далее каждую из клеток, ставших таким образом биофабрикой по производству моноклональных антител, помещают в отдельные луночки объемом 2 мл и отбирают ту, которая способна производить максимальное количество. В луночках объемом 2 мл можно наработать несколько микрограммов антител. А для производства препарата для мировых масштабов нам нужны килограммы. Поэтому начинается процесс масштабирования – поэтапного доведения объемов культуры до нескольких тонн без потери продуктивности. Кроме того, при разработке антител всегда проводится обязательная проверка их безопасности и эффективности на животных и в клинических испытаниях.

Для того чтобы иметь возможность произвести антитела в тонном биореакторе, мировая наука прошла длинный и тернистый путь, преодолевая препятствия, заложенные природой. В природе, напомним, антитела производятся лимфоцитами. Лимфоциты делятся ограниченное число раз. Леонард Хайфлик доказал, что после примерно 50 делений клетки умирают, не оставляя потомства, исчерпывая потенциал деления хромосом. Тупик. Нам нужно очень много потомков одной клетки для наработки промышленно значимых количеств антител, а почти все клетки прекращают делиться, достигая предела Хайфлика. Стоп, что значит «почти»? Раковые, половые и стволовые клетки не имеют предела Хайфлика, они делятся до бесконечности.

1984 год. Мильштейн, Кёлер, Ерне. Нобелевская премия «за открытие принципа продукции моноклональных антител».

В семидесятых годах XX века аргентинский ученый Сезар Мильштейн и немецкий биолог Жорж Кёлер предложили красивое решение проблемы продукции больших объемов клеток. Нужно создать гибрид лимфоцита и раковой клетки миеломы. Такая клетка будет жить вечно, как раковая, и производить антитела, как лимфоцит. Такую клетку назвали гибридома. Все ее потомки будут производить одни и те же антитела и их будет очень много.

Первые моноклональные антитела были получены из клеток лимфоцитов мышей, иммунизированных (привитых) белком-мишенью. Однако мышиные антитела плохо подходят для использования в клинической практике – они вызывают иммунный ответ человеческого организма и быстро выводятся, не успевая добраться до мишени. Поэтому на помощь ученым пришла генная инженерия. Необходимо было заменить части ДНК животного частями ДНК человека так, чтобы клетка вырабатывала антитела не животного, а человека. О как! Нужно было вмешаться в промысел божий и создать новую (рекомбинантную) молекулу, а кроме того научиться размножать клетки млекопитающих в культуре.

1980 год. Фредерик Сенгер, Уолтер Гилберт. Нобелевская премия «за метод секвенирования ДНК».

В середине семидесятых годов XX века Фредерик Сенгер, единственный лауреат двух Нобелевских премий по химии, расплел двойную спираль ДНК и, присоединяя к ней короткие кусочки, оканчивающиеся определенными последовательностями, считал всю цепочку нуклеотидов. Все автоматы-секвенаторы первого поколения построены по принципу метода Сенгера. В результате мы можем узнавать последовательность нуклеотидов в нужных нам генах. На помощь классическим секвенаторам в конце XX века пришли секвенаторы нового поколения: теперь расшифровка ДНК – это рутинная лабораторная работа. В 2003 году завершился проект «Геном человека», запущенный в 1990 году министерством энергетики США и Национальным институтом здравоохранения. Он помог установить строение ДНК человека.

Для того чтобы модифицировать ген, его нужно разрезать в нужном месте и вшить в него новую последовательность нуклеотидов. В каком месте резать, мы знаем благодаря работам Сенгера, про которого уже рассказали. Что вставлять, тоже понятно, поскольку геном человека расшифрован. Осталось выполнить это технически. Если все части антител заменяются на человеческие, то получаются гуманизированные антитела, а если только небольшие кусочки, то химерные.

1978 год. Смит, Арбер, Натанс. Нобелевская премия за «открытие рестрикционных ферментов».

В шестидесятых годах XX века Хемилтон Смит и Вернер Арбер выяснили механизм внедрения ДНК бактериофагов в ДНК бактерий. Когда бактериофаг проникает в бактериальную клетку, он может внедряться в генетическую структуру бактериальной клетки и передаваться дочерним клеткам в процессе деления. Изучение этого механизма привело ученых к открытию рестриктаз («молекулярных ножниц») – ферментов, которые могут разрезать ДНК в строго определенных местах. Если есть фермент, который разрезает, значит, должен быть и фермент, который склеивает. Вскоре он был найден и назван лигазой.

Теперь мы умеем заменить гены, отвечающие за синтез антител животного, на подобные гены человека. Успехи в понимании работы различных участков ДНК и гигантский скачек в математическом моделировании позволяют улучшать антитела. Допустим, антитела отлично сцепляются с клеткой-мишенью, но недостаточно стабильны. Нет проблем, компьютерным моделированием можно вычислить подобную молекулу, которая будет не только лучше сцепляться, но и станет стабильнее прототипа. Осталось чуть-чуть – синтезировать нужные последовательности.

1968 год. Холли, Корана, Ниренберг. Нобелевская премия «за расшифровку генетического кода и его роли в синтезе белков».

В шестидесятых годах XX века индийский биофизик Хар Корана в ходе работ по расшифровке генетического кода придумал метод синтеза генов. По сути Корана научился склеивать нуклеотиды в нужной последовательности. В 1976 году впервые были синтезированы и клонированы два небольших полноразмерных гена, в 1977 году был синтезирован и клонирован ген, кодирующий человеческий белок соматостатин.

1993 год. Кэри Муллис. Нобелевская премия «за изобретение метода полимеразной цепной реакции».

В 1983 году американский биохимик Кэри Муллис изобрел полимеразную цепную реакцию. ДНК создается путем копирования разных кусков исходного кода с заданными условиями в новую структуру. ПЦР-реакция позволяет рутинным лабораторным методом синтезировать очень длинные последовательности.

Вот теперь у нас есть все. Мы можем синтезировать нужные нам гены человека, можем вставлять их в клетки животных, можем получать бесконечно делящиеся в биореакторах клетки млекопитающих и нарабатывать нужное количество антител с точно определенными свойствами. Однако, не успев развиться, гибридомная технология успела устареть. Современные методы создания белков выглядят так: полученный в пробирке ген имплантируется в бесконечно делящуюся клетку млекопитающих.

1954 г. Эндерс, Уэллер, Роббинс. Нобелевская премия «за открытие способности вируса полиомиелита расти в культурах различных тканей».

В середине XX века полиомиелитом только в США заболевали более 20 тысяч человек. Перенес это заболевание и президент США Франклин Делано Рузвельт. Вирус полиомиелита, как считалось в то время, размножается только в нервной ткани, что делает невозможным производство сколько-нибудь значимых количеств вакцины из ослабленных вирусов. Поддерживать культуру нервных клеток было чрезвычайно трудно. Необходимо было найти способ культивирования. Эндерс, Уэллер и Роббинс нашли условия, при которых полиовирус размножался в культуре клеток эмбрионов человека и обезьяны. Таким образом можно было получать большие количества полиовируса «в пробирке».

Теперь у человечества был способ культивирования клеток вне организма. В 1952 году была получена известная линия бессмертных клеток человека НеLa.

Клетки клонируются в маленьких лунках объемом в 2 мл, потом содержимое переливается в колбочки, потом в реакторы. Клетки делятся в растворе очень сложного состава: 200 компонентов, несколько газов, строго поддерживаемая температура, абсолютная стерильность, контролируемое перемешивание.

Клетки клонируются и клонируются до объемов в одну тонну. После этого из раствора удаляются клетки-производители, специальными осмотическими фильтрами раствор, в котором производилось клонирование, заменяется физраствором, производятся сложные очистки готового белка. Конечный продукт – это двести килограммов сыворотки моноклональных антител, которые разливаются по шприцам. 200 килограммов – это годовая потребность России в таком препарате.

На основе моноклональных антител делают несколько классов медицинских препаратов. Во-первых – для лечения рака. Мы можем пометить раковую клетку антителом и организм убьет ее иммунным ответом. Во-вторых, мы можем соединить антитела с радиоактивным компонентом, получив метод высокоточной диагностики (мы помним, что полученные антитела очень специфичны и доставят метку только к «своей» раковой клетке). А можем и убить клетку прикрепленным к антителу токсином, не тронув соседние. В третьих, мы можем снять блок распознавания, вырабатываемый раковой клеткой, и тогда такие клетки рака будут распознаваться и уничтожаться иммунной системой. Кроме того, мы можем снизить автоиммунный ответ, блокируя сигнальные молекулы. В этом случае мы получим препараты против псориаза и артрита.

Биотехнологическая Корпорация «BIOCAD»
«BIOCAD» – это два завода, два исследовательских центра, кафедра на базе химико-фармацевтической академии, 1000 сотрудников, из которых 350 занимаются разработкой новых препаратов, и оборот за 2015 год в 10 млрд рублей. Офисы и представительства компании расположены в США, Бразилии, Китае, Индии, Сингапуре и других странах. Препараты предназначены для лечения рака, ВИЧ, гепатита, рассеянного склероза.
В начале 2000-х годов банкиру Дмитрию Морозову стало скучно. Захотелось заработать денег на чем-то, отличном от дырки в земле. Миф о многочисленных российских научных разработках оказался мифом, пришлось делать всю цепочку самому, от разработки молекул до упаковки готовых препаратов. Получилась Корпорация.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru
 12.04.2016

Читать статьи по темам:

антитела лечение рака биофармацевтика разработка препаратов фармпроизводство Версия для печати
Ошибка в тексте?
Выдели ее и нажми ctrl + enter
назад

Читать также:

Плюсы и минусы терапии моноклональными антителами

По мнению авторов статьи, терапия моноклональными антителами, несмотря на ее коммерческую привлекательность, не является перспективным направлением при длительном лечении.

читать

Пластырь с микроиглами против меланомы

Покрытый микроиглами пластырь обеспечивает стабильное прицельное высвобождение иммунопрепаратов непосредственно в меланому, что позволяет уничтожать опухоль с минимальным риском развития побочных эффектов.

читать

От клеточной биологии – к клеточной терапии

За исследования в области клеточной биологии были присуждены две премии Правительства Москвы для молодых учёных 2014 года в номинации «Биология и медицинские науки».

читать

Моноклональные антитела в онкологии

Моноклональными они называются потому, что их вырабатывают клетки-клоны, полученные от одной-единственной клетки-предшественницы. Моноклональные антитела различаются не только по своей целевой мишени, но и по способу борьбы с раковыми клетками.

читать

Иммунитет против рака

Иммунотерапия открыла совершенно новую возможность для лечения рака наряду с химиотерапией, лучевой терапией и хирургией.

читать

Новая стратегия иммунотерапии рака

Исследователи из Массачусетского технологического института разработали новую методику иммунотерапии рака. Суть технологии заключается в объединении работы двух основных ветвей иммунной системы.

читать