Неонатальная генодиагностика в Петербурге: подробности
Новый этап развития неонатального скрининга в России
Максим Руссо, Полит.ру
С февраля 2015 года при проведении неонатального скрининга Медико-генетический диагностический центр Санкт-Петербурга начнет применять для генетического анализа решение VariFind™ Neoscreen assay, основанное на технологии высокопроизводительного секвенирования нового поколения. Решение было разработано компанией Parseq Lab при поддержке фонда «Сколково».
«Пилотная клиническая апробация продлится примерно 9 месяцев и затронет тестированием порядка 1000 детей. По окончании данного этапа будет создано технико-экономическое обоснование применения нового метода и поставлен вопрос о дальнейшем использовании нового подхода как в самом Медико-генетическом центре, так и в других регионах России», – уточнил руководитель компании Parseq Lab Александр Павлов (на снимке).
Такая апробация необходима, чтобы в реальном клиническом протоколе на базе действующего медицинского учреждения (Медико-генетическом центре) продемонстрировать, что применение данного подхода дает лучшие результаты, чем используемые в настоящий момент методы. Диагностические свойства используемого решения уже были предварительно определены в мультицентровых клинических испытаниях, на основании чего был сделан вывод о применимости метода в медицинской практике.
Мы попробуем разобраться, чем новое решение для выявления тяжелых наследственных заболеваний у новорожденных отличается от прежних методов диагностики.
С начала 2000-х в России началось внедрение неонатального скрининга – массового обследования всех новорожденных для раннего выявления некоторых наследственных заболеваний. В 2006 году в программу обязательного тестирования вошли три заболевания: адреногенитальный синдром, галактоземия и муковисцидоз. Позднее к ним прибавились фенилкетонурия и врожденный гипотиреоз.
Зачем это нужно? Как можно более ранний диагноз в случае этих заболеваний может иметь решающее значение для жизни и здоровья ребенка. Дело в том, что клинические проявления, заметные специалистам, наступают не сразу, а, возможно, через месяцы после рождения. Одновременно раннее начало лечения позволяет значительно снизить тяжесть течения заболевания, улучшить прогноз и качество жизни.
Давайте рассмотрим конкретные примеры. Если у ребенка фенилкетонурия, его организм не может нормально метаболизировать молекулу фенилаланина – одной из аминокислот, поступающих с пищей. Накапливаясь в организме, производные фенилаланина отрицательно действуют на нервную систему, что в итоге может привести к серьезной умственной неполноценности. Если же мы выявим заболевание сразу после рождения, то, чтобы избежать последствий, нужно лишь следить, чтобы в пище не было продуктов, содержащих большое количество фенилаланина. Такую диету больному придется соблюдать как минимум до полового созревания. Зато отрицательных последствий для здоровья он избежит (хотя носительство мутаций, связанных с фенилкетонурией останется и может в дальнейшем быть передано потомству).
Галактоземия характеризуется другим нарушением в обмене веществ. Организм не может превращать галактозу, поступающую с молоком, в глюкозу. В результате галактоза накапливается и приводит к нарушениям в нервной системе и печени, а также может вызвать изменения в хрусталике глаза. Как следствие у ребенка в первые недели жизни может развиться тяжелое поражение печени и гомеостаза, иногда имеющие летальные последствия. Раннее определение галактоземии также позволит выбрать нужную диету, в частности исключить молоко, что снизит риск серьезных осложнений.
Самое частое моногенное заболевание человека – муковисцидоз – вызывается мутациями в гене CFTR, находящемся в седьмой хромосоме. Данный ген и синтезирующийся с него белок отвечает за перенос ионов хлора через клеточную мембрану. В зависимости от того, какая именно мутация произошла, заболевание может иметь разную степень тяжести. В случае муковисцидоза раннее начало терапии помогает снизить тяжесть его течения. Во многом именно благодаря неонатальному скринингу в Западной Европе средняя продолжительность жизни больных муковисцидозом сейчас превысила 40 лет, а в Канаде достигла 50. В России она пока значительно ниже.
Как происходит скрининг? Обычно анализ проводится в первую неделю жизни ребенка. В роддоме у младенца на специальный бумажный бланк берут немного крови из пятки (поэтому скрининг часто называют «пяточным тестом»). Далее в лаборатории по образцу крови определяют маркеры перечисленных заболеваний – характерные вещества, которые присутствуют в организме и здоровых, и больных людей, только в разных количествах. В России для этого используются иммунохимические методы исследования. Метод хорош тем, что для анализа достаточно небольшого количества крови из сухого пятна, но с его применением связан ряд проблем.
Выберем для примера муковисцидоз. В качестве его маркера обычно используется иммунореактивный трипсиноген в плазме крови. Собственно, на определении повышенного содержания трипсиногена были основаны первые методы массового неонатального скрининга в 1980-х. Однако повышение концентрации этого биохимического параметра в крови новорожденного наблюдается не только при муковисцидозе. Это случается также при желтухе новорожденных, глубокой недоношенности, трисомиях 13-й и 18-й хромосом, у детей с врожденными инфекциями, почечной недостаточностью и атрезией тонкого кишечника, а также в случае нефрогенного несахарного диабета. Более того, если мать нарушит предписание врачей: не кормить ребенка грудью в течение трех часов до взятия крови из пятки, то в крови также может обнаружиться повышенное содержание трипсиногена. В результате тест даст ложно-положительный результат, который будет стоить немалого числа седых волос родителям, пока не будет проведен повторный анализ. Количество ложноположительных случаев первичного тестирования достигает 2% от общего числа новорожденных, при том, что частота заболевания (истинно-положительный результат) в нашей стране составляет около 0,01%.
Что же делать? На помощь приходит молекулярная генетика. Все перечисленные заболевания вызываются мутациями в конкретных генах. Значит, определение наличия или отсутствия мутации в геноме пациента позволит дать дополнительную ценную информацию для снятия или подтверждения диагноза. В 1990-х для диагностики стали применять метод тестирования на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), когда при помощи фермента ДНК-полимеразы из определенного фрагмента ДНК можно получить большое количество его копий. Многократное умножение количества целевого региона ДНК позволяет преодолеть пределы детекции методов обнаружения мутаций (проще говоря, чтобы количество данного фрагмента ДНК было достаточным для его обнаружения).
Этот метод дает достаточно точный ответ, но, к сожалению, лишь на очень конкретный вопрос: есть ли определенная мутация в ДНК пациента. Одновременно, в ДНК могут иметься другие мутации, тестирование которых в рамках этого метода предусмотрено не было или в принципе осуществить нельзя. Если бы каждая из генетических болезней вызывалась одной-единственной мутацией, ПЦР было бы достаточно. Но в действительности, известно, например, более тысячи мутаций гена CFTR, которые связаны с развитием муковисцидоза, при этом сотни из них «ответственны» за разные формы заболевания. В определенных регионах и у определенных этнических групп наиболее распространены конкретные мутации. Например, есть мутация, вызывающая примерно 75% случаев муковисцидоза у европейских детей. А в Южной Америке она определяет лишь 25% случаев. Использование для исследования метода ПЦР позволяет обнаружить лишь одну или счетное количество различных мутаций. Если же мы хотим проверить широкий спектр мутаций, связанных с развитием муковисцидоза, то нам надо изготовить и провести сотни различных ПЦР-исследований, что займет слишком много времени и будет стоить достаточно дорого.
Поэтому обычно для генетического анализа выбирают набор из наиболее частых в данной популяции мутаций. Но когда этнический состав неоднороден, точность и достоверность диагностики резко падает. В Европе проводились исследования, которые показали, что обычные ПЦР-тесты выявляют только половину случаев муковисцидоза, если дети происходят из семей североафриканского или турецкого происхождения. Понятно, что эта проблема очень актуальна и для такой обширной и мультиэтнической страны как Россия.
Системное решение данной проблемы как раз и предлагается в методе, который создан специалистами петербургской компании Parseq Lab. Он способен выявлять широкий спектр мутаций в генах муковисцидоза, фенилкетонурии и галактоземии, и заключается в прямом «прочтении» – секвенировании всей последовательности ДНК пациента на интересующих участках генома. Определив последовательность ДНК, можно сразу увидеть, присутствуют ли в ней нарушения, приводящие к развитию генетических заболеваний. На данный момент система VariFind™ Neoscreen assay может определять более 460 клинически значимых мутаций, из которых 320 связаны с развитием муковисцидоза.
Также эту систему отличает возможность простого расширения базы выявляемых мутаций. Если в будущем, в ходе исследований будет показано, что муковисцидоз вызывает еще какая-нибудь ранее не учтенная мутация гена CFTR, ее можно будет оперативно добавить в тест-систему, чтобы при анализе она уже не была упущена.
Таким образом, включение в неонатальный скрининг генетического анализа повышает общую точность исследования, а использование для этого так называемого метода «секвенирование нового поколения» (next-generation sequencing, NGS) позволяет одновременно проверить практически любое количество мутаций и значительно быстрее.
Генеральный директор компании Parseq Lab Александр Павлов отметил, что в данный момент родители ничего не платят за неонатальный скрининг: «Для новорожденных все исследования делаются бесплатно, так как это все происходит в рамках государственной программы. В прошлом году закупка, которая была сделана Медико-генетическим центром, шла в рамках субсидии правительства Санкт-Петербурга на модернизацию и развитие диагностической службы города. Результаты данной апробации должны убедить специалистов и чиновников, что использование современных методов диагностики позволяют повысить эффективность принятой схемы и данный вид исследований будет субсидироваться так же, как и вся программа в целом».
По его словам, за один запуск прибора можно сделать анализ для 48 пациентов. «Набирается группа пациентов, у которых есть подозрение на наследственное заболевание, и тестируется вместе в рамках одного запуска прибора. Все исследование занимает при этом около трех дней», – уточнил Павлов.
Руководитель компании также отмечает, что в России не всегда понятны алгоритм и процедура получения разрешения на использование медицинских изделий: «Это касается современных технологий, инновационных разработок, диагностических решений – если у таких продуктов нет аналогов, это может стать препоной для быстрого внедрения новинок в клиническую практику. Часто даже сами эксперты признаются, что еще не сталкивались с такими технологиями в своей практике. Мы, так или иначе, преодолеваем такие препятствия, но не все могут пройти через этот этап. Если решение не сертифицировано, то широкого применения оно получить не сможет. Более того, за последние 3 года правила регистрации медицинских изделий несколько раз менялись из-за чего сроки получения разрешения растягиваются на годы».
Справляться с трудностями Parseq Lab помогает Сколково: ранее команда уже была резидентом фонда, сейчас же подала новую заявку, связанную с разработкой биоинформатических решений и системы обработки больших данных в геномике. «Изначально Фонд «Сколково» позволил нам войти в некую «экосистему», где мы завели большое количество контактов, партнерских отношений, участвовали во всевозможных мероприятиях и были вовлечены в процессы развития и дальнейшей коммерциализации инновационных разработок. Мы участвовали в большом количестве всевозможных инициатив и программ институтов развития, на данный момент Сколково в этом отношении выглядит наиболее профессионально», – рассказал Александр Павлов.
По словам Юрия Никольского, директора по науке Кластера биомедицинских технологий Фонда «Сколково», БМТ кластер с большим энтузиазмом поддержал инновационный проект компании. «Во-первых, своевременная и точная диагностика врожденных заболеваний является одной из основ современной медицины, и мы счастливы видеть «state of art» решение, целиком разработанное российской компанией. Во-вторых, assay и сервис Parseq lab основаны на NGS секвенировании, относительно новой технологии, которая только начинает входить в клинику. NGS технология обеспечивает высокую точность и потенциально низкую стоимость теста, что важно для нашего здравоохранения. Хотим отметить высокий уровень биоинформатического анализа проводимого в тесте и уникальность базы врожденных мутаций собранную Parseq lab», – подчеркнул Юрий Никольский.
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru
30.01.2015