Подписаться на новости
  • Сенатор
  • ООО "Ай Вао"
  • Биомолтекст2020
  • vsh25
  • Vitacoin

Белки из неприродных аминокислот: начало пути

Слово из четырёх букв
Антон Чугунов, «Биомолекула»

Одним из наиболее удивительных открытий в биологии XX века стала расшифровка генетического кода, причём особенно трудно было понять, что такой код существует. Пожалуй, самым поразительным свойством этого «языка» является его универсальность – за исключением некоторых «диалектов», он одинаков для всех доменов жизни на Земле. В начале XXI века учёные сумели «перепрошить» генетический код, добавляя к стандартным аминокислотам неприродное звено, кодируемое стоп-кодоном в матричной РНК и считываемое при участии «ортогональных» тРНК. (Правда, при этом в белкé может быть только одно нестандартное звено.) Теперь дело поворачивается в сторону полностью «настраиваемых» белков: английским исследователям удалось создать рибосому, считывающую за раз не три, а четыре нуклеотида, что потенциально позволяет использовать для дизайна биополимеров более 250 неприродных аминокислот.

Расшифровка генетического кода стала одним из впечатляющих проявлений работы научной мысли в XX веке. На осознание самого факта существования генетического кода – то есть, однозначного соответствия последовательностей ДНК и кодируемых в ней белков – ушло более века, в то время как на его расшифровку не потребовалось и десятилетия. Промежуточными вехами на этом пути стали принцип матричного дублирования, принадлежащий Н. К. Кольцову, идеи Э. Шрёдингера о кодировании информации в химической структуре генов, модель двойной спирали ДНК Дж. Уотсона и Ф. Крика и неожиданный вклад физика Г. А. Гамова в формулировку проблемы триплетного генетического кода. Увенчали эту цепочку работы Ф. Крика с сотрудниками, экспериментально открывшими хрестоматийные качества генетического кода – триплетность, слитность, ориентированность и вырожденность [1].

Поразительно, но генетический код практически одинаков для всех известных на Земле организмов, и это продолжает подтверждаться с появлением всё новой и новой геномной информации. Конечно, этот код не является чем-то статичным: он продолжает эволюционировать, что позволяет объяснить небольшие отличия, наблюдаемые у разных организмов (архебактерий, микоплазм, некоторых простейших) или даже для отдельных субклеточных органелл (митохондрий) [2]. Однако человеку мало изучить, как устроено живое: примеряя на себя роль творца, он стремится воспроизвести или даже создать жизнь «с нуля» [3], в связи с чем учёные снискали уже немалую дозу праведного негодования со стороны не столь любознательно настроенных групп граждан.

Новомодная парадигма, получившая название синтетической биологии, подходит к изучению устройства жизни не разбирая её на части, а, наоборот, стараясь воспроизвести её на основе элементарных блоков, фактически стерев границу между живой и неживой материей. Сторонники этого подхода крайне заинтересованы в получении белковых молекул с новыми свойствами (в том числе, включающих неприродные аминокислоты), не говоря уже о более «приземлённых» фармакологах и биотехнологах, для которых такие белки могут в прямом и переносном смысле стать золотой жилой. (Всё это совсем не означает, впрочем, что потенциал природных белков и белков, построенных из природных аминокислот, исчерпан.)

Число различных неприродных аминокислот, которые можно «встроить» в белóк генетическим (а не синтетическим) путём, естественно ограничено числом доступных кодонов – трёхбуквенных «слов», из которых состоит язык генетического кода. Хотя всего двадцать (22, если считать пирролизин и селенцистеин) природных аминокислот кодируются аж 64 кодонами, высокая вырожденность кода приводит к тому, что все триплеты «заняты», и даже использование синонимичных кодонов для вставки нестандартных аминокислот нежелательно, поскольку это может нарушить работу всей системы в целом.

В связи с «занятостью» кодонов для вставки нестандартных звеньев обычно используют стоп-кодон UAG (amber), распознаваемый вводимой в систему особой «ортогональной» тРНК (см. Expanded genetic code). Слово «ортогональный» тут будет использоваться для обозначения добавляемых извне тРНК и соответствующей аминоацил-тРНК-синтетазы, которые не взаимодействуют с другими клеточными компонентами, кроме рибосомы. Наибольшее распространение в этой сфере получила пара тирозиновой тРНК и тирозил-тРНК-синтетазы из архебактерии Methanococcus jannaschii, которая позволяет «перепрограммировать» стоп-кодон amber в других бактериях (например, E. Coli) на тирозин или – для чего всё и затеивалось – неприродную аминокислоту.

Британские исследователи из Кембриджа идут по пути «освобождения рибосомы»: их задачей стало расширение репертуара неприродных аминокислот, которые можно одновременно ввести в синтезируемый белóк. Последнее достижение лаборатории Джейсона Чина (Jason Chin) – создание модифицированных рибосом, способных считывать генетический код не триплетами, а квадруплетами (по 4 основания), что потенциально позволяет кодировать до 256 (!) аминокислот [4]. Путём молекулярной селекции учёные «вывели» мутантный вариант рибосомы (она получила название Q1 –  см. рисунок 1), эффективно распознающую квадруплеты (для целей селекции в «квадруплетной» рамке считывания был закодирован ген устойчивости к антибиотику). Конечно, будь все рибосомы в клетке такими, это стало бы летальным, но они существуют независимо от «нормальных» рибосом и не мешают им синтезировать клеточные белки (то есть тоже являются ортогональными).

Рисунок 1. Молекулярная «селекция» рибосом, распознающих квадруплетные кодоны [4]. Селекция основана на библиотеках 16S рРНК в «ортогональной» рибосоме ribo-X, ранее созданной в лаборатории Чина [5]; замены в рРНК затронули в сумме 127 нуклеотидов. Две замены, расположенные вблизи сайта связывания тРНК, привели к тому, что один из вариантов (он получил название Q1) может эффективно декодировать квадруплетные кодоны, сохранив при этом способность считывать «стандартные» триплеты. (Кстати, эффективность распознавания квадруплета и доля ошибочных прочтений тут не хуже, чем у обычных рибосом.) Селекция была основана на устойчивости к антибиотику хлорамфениколу, которая возникала только в том случае, если рибосоме удавалось прочесть ген устойчивости, расположенный «за замком» квадруплетного кодона AAGA в генетической конструкции, специально для целей селекции добавляемой в среду. (Также добавляли «дизайнерский» вариант сериновой тРНК, антикодон в которой длиной те же четыре нуклеотида – UCUU.)

Способность «квадруплетной» рибосомы Q1 считывать не только природные триплеты, но и «слова из четырёх букв» (квадруплеты) позволяет использовать её для вставки в белок множества неприродных аминокислот одновременно, что было невозможно раньше.

Для начала был получен вариант белкá кальмодулина, в который ввели две неприродные аминокислоты, содержащие азидную и алкиновую группы. При пространственном сближении эти аминокислоты соединяются по механизму синхронного присоединения Хьюсгена и создают в белке дополнительное «ребро жёсткости» (рисунок 2). Исследователи отмечают, что это подтверждает практическую пользу квадруплетных рибосом для задач биоинженерии и синтетической биологии.

(Реакции синхронного присоединения – реакции присоединения, в которых атака на оба атома кратной связи осуществялется одновременно. Другое название реакций этого типа – реакции циклоприсоединения, так как конечным продуктом таких реакций являются циклические субстраты.
Существует две основных реакции этого типа: присоединение к сопряженным системам – реакция Дильса-Альдера, англ. Diels-Alder reaction, и 1,3-диполярное циклоприсоединение – реакция Хьюсгена, англ. Huisgen reaction.)


Рисунок 2.
Генетически закодированная циклизация кальмодулина посредством Cu(I)-зависимой реакции Хьюсгена.
Вместо первого и последнего остатка в кальмодулин помощью квадруплетной рибосомы
и соответствующих ортогональных тРНК и аминоацил-тРНК-синтетаз
были вставлены неприродные аминокислоты:
пара-азидо-фенилаланин и N6-[(2-пропинилокси)карбонил]-лизин, соответственно.
(Использовались квадруплетный кодон AGGA и «стандартный» стоп-кодон UAG.)
На расшифрованной пространственной структуре видно,
что эти два остатка действительно участвуют в «клик-реакции»,
образуя сшивку, которую сложно получить другими способами [4]
.

Однако создание квадруплетной рибосомы – это только часть задачи, что видно хотя бы из того, что для циклизации кальмодулина использовали только один квадруплетный кодон, а второй «по старинке» был стандартным для этих целей стоп-кодоном UAG. Видимо, дело в том, что у исследователей не нашлось двух взаимно ортогональных квадруплетных пар тРНК/тРНК-синтетаза. «Получив рибосому, способную считывать массу кодонов-“пустышек”, задаёшься вопросом, где же достать тРНК и соответствующие синтетазы, которые позволили бы использовать этот потенциал?» – вопрошает Чин [7]. Однако он сам же себе уже и ответил в научной печати – его лаборатория опубликовала первую работу по созданию пар ортогональных тРНК/аминоацил-тРНК-синтетаз, внося в них по определённой программе мутации [6]. Эта возможность открывает путь к тотальной «настройке» белкá, в который в будущем можно будет вставлять практически любые звенья, не ограничиваясь лишь двадцатью природными, и многие учёные уже назвали эти достижения новой эрой в биоинженерии.

Невероятно, что оказалось возможным взять такой невообразимо сложный механизм как трансляция белка и «перепрошить» его в своих целях, но это, кажется, только начало.

Литература

  1. В. А. Ратнер. (2000). Генетический код как система. Соросовский образовательный журнал 6, 17–22;
  2. биомолекула: Эволюция генетического кода;
  3. биомолекула: Смыслы „жизни“;
  4. Neumann H., Wang K., Davis L., Garcia-Alai M., Chin J.W. (2010). Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature 464, 441–444;
  5. Wang K., Neumann H., Peak-Chew S.Y., Chin J.W. (2007). Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat. Biotechnol. 25, 770–777;
  6. Neumann H., Slusarczyk A.L., Chin J.W. (2010). De novo generation of mutually orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase/tRNA pairs generation of mutually orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase/tRNA pairs. J. Am. Chem. Soc. 132, 2142–2144;
  7. C&EN – Expanding The Genetic Code.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru
23.03.2010

Читать статьи по темам:

синтетическая биология биомолекулы Версия для печати
Ошибка в тексте?
Выдели ее и нажми ctrl + enter
назад

Читать также:

Инструкцию для синтеза неземных белков написали словами из четырех букв

Чтобы синтезировать в живых клетках не существующие в природе белки, содержащие искусственные аминокислоты, пришлось изменить структуру рибосом, научив их читать кодоны из четырех нуклеотидов.

читать

Биотехнология: магистральные пути развития

Бурное развитие современных биотехнологий идет сразу по нескольким ключевым направлениям, в каждом из которых уже достигнуты многообещающие результаты.

читать

Инновации в области наук о живом-2009: № 3

Клетки с модифицированными генами двух белков под действием направленных пучков света изменяли форму, как перчаточные марионетки.

читать

Биодизель из опилок

Новый штамм кишечной палочки продуцирует высококачественное дизельное топливо и другие ценные химические соединения из необработанной растительной биомассы.

читать

Бактериальные часы – усовершенствованная версия

Живой часовой механизм – колония генетически модифицированных бактерий, которые, благодаря простейшей генетической схеме, испускают ритмичные синхронизированные импульсы флуоресцентного излучения.

читать

Система автоматизации проектных работ по созданию живого организма

Программа TinkerCell, аналог САПР для визуального моделирования молекулярно-биологических процессов, должна стать мощным инструментом для синтетической биологии.

читать