Биосенсоры (ч.2)

Продолжение. Начало статьи – здесь.

Технические стратегии

Технические стратегии, применяемые для разработки биосенсоров, основаны на выявлении биомаркеров с использованием и без использования меток. Выявление с использованием меток основано преимущественно на специфичных свойствах метящих соединений, применяемых для прицельного выявления. Биосенсоры такого типа надежны, однако часто требуют комбинации специфичных чувствительных элементов, изготавливаемых с использованием иммобилизованного белка-мишени. С другой стороны, не использующий меток метод позволяет выявлять молекулы-мишени, не пригодные для мечения. Последние междисциплинарные подходы в области биотехнологии и биоинженерии, электротехники и электроники проложили дорогу разработке не использующих метки биосенсоров для различных методов выявления с широким спектром направлений применения в области медицины и науки об окружающей среде.

Электрохимические биосенсоры

Уже ставшее классикой создание глюкометра на основе глюкозооксидазных биосенсоров является первым шагом в истории разработки электрохимических биосенсоров. Глюкозные биосенсоры очень популярны в клиниках и диагностических учреждениях, так как они необходимы для периодического мониторинга уровня глюкозы в крови пациентов с сахарным диабетом. Однако эти биосенсоры имеют недостатки в силу нестабильной активности или негомогенности фермента, обуславливающей важность дополнительной калибровки. Фактически эти потенциальные недостатки привели к разработке спектра биомолекул, обладающих различными электрохимическими свойствами, что обусловило появление более стабильно работающих биосенсоров глюкозы. В последнее время электрохимические биосенсоры, как правило, изготавливаются путем модифицирования поверхности металлических и углеродных электродов с использованием биоматериалов, таких как ферменты, антитела или ДНК. Выходной сигнал биосенсора обычно генерируется в результате специфичных реакций связывания или каталитических реакций между материалами на поверхности электрода. Необходимость разработки электрохимических сенсоров стала особенно актуальна для клинической диагностики заболеваний, в которых большое значение имеет раннее выявление или мониторинг. В данном контексте для разработки не-ферментативных биосенсоров вместо белков рассматриваются синтетические материалы. Интересен тот факт, что различные типы биомолекул обладают разной стабильностью и избирательностью, что в конечном итоге позволяет разрабатывать новые типы электрохимических биосенсоров для разных целей. В зависимости от сферы применения были разработаны разные типы электрохимических биосенсоров, а биосенсоры глюкозы претерпели стремительную эволюцию.

Еще одним современным изобретением является биохимический сенсор для оценки уровней активных форм кислорода в физиологических системах. Важным областью применения данного направления представляется выявление мочевой кислоты как наиболее важного конечного продукта метаболизма пурина в биологических жидкостях организма, которое может выступать в роли инструмента для диагностики различных клинических аномалий и заболеваний. Однако исключительно важной задачей является разработка экономически эффективного и чувствительного метода. Аналогично ситуации с количественным измерением уровня глюкозы, электрохимический подход к оценке уровня окисления мочевой кислоты выглядит идеальным претендентом. Однако сходство с точки зрения окислительных процессов мочевой кислоты с аскорбиновой кислотой серьезно затрудняет разработку высокочувствительного электрохимического биосенсора. Для преодоления этой проблемы авторы разработали биосенсор на основе амперометрического выявления (amperometric detection), позволяющего измерять как восстановительный, так и окислительный потенциалы. Учитывая стоимость и воспроизводимость данной процедуры, важным моментом является иммобилизация или нанесение ферментов на поверхность обычных электродов или электродов на основе наноматериалов, идеальных для разработки одноразовых избирательных, экономически эффективных и чувствительных биосенсоров для рутинного измерения уровней мочевой кислоты. В этом отношении очень перспективными выглядят недавние достижения в области трехмерной биопечати, целью которых является создание биосенсоров на основе живых клеток, инкапсулированных в трехмерное микроокружение. К этому же направлению относится недавно разработанный беспроводной биосенсор-капа для непрерывного определения в режиме реального времени концентрации мочевой кислоты в слюне. Эта технология может быть использована в разработке пригодных для ношения на теле устройств, для мониторинга различных параметров состояния здоровья. Электрохимические сенсоры уже успешно применялись для измерения уровня гормонов, однако перспективы применения данного подхода еще требуют детального рассмотрения. В основе еще одного потенциального направления технологических разработок в области биосенсоров лежит прицельное воздействие на нуклеиновые кислоты. Хорошо известно, что клеточная экспрессия малых интерферирующих РНК (миРНК) является идеальным биомаркером для диагностики манифестации болезни и воздействие на нее повышает эффективность генной терапии генетических заболеваний. Обычно миРНК выявляются с помощью нозерн-блоттинга, микрочипов и полимеразной цепной реакции (ПЦР). Современные технологии позволяют создавать идеальные электрохимические биосенсоры для выявления миРНК, принцип действия которых основан на безметочной идентификации реакции окисления гуанина, запускаемой формированием гибрида между миРНК и соответствующим зондом захвата на основе аналога инозина. Все эти изобретения появились благодаря современным подходам, применяемым для продвижения технологии электрохимических биосенсоров в биомедицине.

Мониторинг состояния окружающей среды является еще одним важным направлением, в котором технология биосенсоров востребована для быстрого выявления остаточных количеств пестицидов для устранения угрозы здоровью человека. Традиционные подходы, такие как высокопроизводительная жидкостная хроматография, капиллярный электрофорез и масс-спектрометрия, эффективны как методы выявления пестицидов в окружающей среде, однако они имеют ограничения, обусловленные сложностью реализации, большими временными затратами, потребностью в высокотехнологичных инструментах и эксплуатационными возможностями. Поэтому простые биосенсоры имеют огромное преимущество, но разработка унифицированного устройства для анализа различных классов пестицидов является очень сложной задачей. Для решения этой проблемы были разработаны биосенсоры на основе ферментов, а именно ингибитора ацетилхолинестеразы, позволяющие определять физиологической вклад пестицидов в окружающую среду, продовольственную безопасность и контроль качества. За последние 10-20 лет эта технология была еще более усовершенствована для быстрого проведения анализа с помощью методов иммобилизации и других стратегий изготовления. Аналогичным образом пьезоэлектрические биосенсоры были разработаны для выявления влияния на окружающую среду фосфаторганических и карбаминовокислых пестицидов. Известно, что хлорорганические пестициды оказывают неблагоприятное влияние на окружающую среду, при этом такие, как эндосульфан, могут наносить серьезный ущерб. Пестициды этого класса по-разному воздействуют на репродуктивную систему самцов и самок рыб. Учитывая этот факт, а также феномен биологического накапливания (биомагнификации), изобретение биосенсоров для анализа водных экосистем было бы очень полезно. Для того, чтобы удовлетворить эту потребность в области биосенсоров произошла революция, в рамках произошел быстрый прогресс в методах изготовления и использования наноматериалах, кварцевых кристаллов или диоксида кремния. Очень важно уделять особое внимание выбору рецепторов для разработки биосенсоров, использованию различных технологий преобразования сигнала и стратегий быстрого скрининга для применения в областях пищевой и экологической безопасности, а также мониторинга. Для достижения этого большое значение имеет изготовление биосенсоров; достижения в этой области четко описаны ниже.

Оптические/визуальные биосенсоры

Как описано выше, биомедицинские и экологические направления требуют разработки простых, быстро работающих и высокочувствительных биосенсоров. Это может быть реализовано с помощью иммобилайзеров, которые могут изготавливаться из золота, материалов на основе углерода, кварца или стекла. Фактически инкорпорирование золотых наночастиц или квантовых точек с использованием метода микротехнологии представляет собой новую технологию разработки высокочувствительных и портативных биосенсоров на основе фермента цитохрома Р450 для применения в определенных целях. Более того, оптоволоконные химические сенсоры очень актуальны для различных областей, таких как поиск новых лекарственных средств, биозондирования и биомедицины. В последнее время гидрогели, применявшиеся в качестве сенсоров на основе ДНК, приобретают популярность в качестве материалов для иммобилизации в оптоволоконной химии. По сравнению с другими материалами иммобилизация в гидрогеле происходит а трех измерениях, что обеспечивает загрузку большого количества чувствительных молекул. Гидрогели (полиакриламид) представляют собой гидрофильные полимеры с поперечными связями, которым для иммобилизации можно придавать разные формы, начиная от тонких пленок и заканчивая наночастицами. Гидрогели считаются простым субстратом для иммобилизации ДНК, обладающие рядом преимуществ, таких как возможность удержания молекул, их контролируемого высвобождения, обогащения аналитов и защиты ДНК. Эти характеристики уникальны для гидрогелей по сравнению с другими материалами, пригодными для биомолекулярной иммобилизации. Более того, хорошая оптическая прозрачность гидрогелей предоставляет возможность применения удобной стратегии визуального выявления. Методы иммобилизации ДНК-биосенсоров в монолитных полиакриламидных гелях и гелевых микрочастицах часто рассматриваются как техническое достижение в области биосенсорных технологий. Выявление единичных молекул для идентификации ДНК также стало возможным с помощью электрохимического окисления гидразина.

Биосенсоры на основе оксида кремния, кварца и стекла

Поиск новых методов разработки биосенсоров привел к использованию обладающих уникальными свойствами материалов из оксида кремния, кварца и стекла. Среди этих материалов особое место заниманию наноматериалы на основе оксида кремния, обладающие наиболее высоким потенциалом для использования в производстве биосенсоров благодаря своей биосовместимости, доступности, а также электронным, оптическим и механическим свойствам. Более того, такие материалы нетоксичны, что является очень важным условием для биомедицинских и биологических сфер применения. Материалы на основе оксида кремния могут использоваться для биовизуализации, биосенсорного анализа и в терапии рака. Помимо этого флуоресцирующие материалы на основе оксида кремния уже давно применяются в биовизуализации. Интересен тот факт, что нанопровода из оксида кремния в комбинации с золотыми наночастицами представляют собой гидридные структуры, применяемые в рамках революционных подходов к лечению рака. Ковалентное прикрепление модифицированных тиолом олигомеров ДНК к оксиду кремния или стеклу обеспечивает формирование ДНК-пленок, повышающих эффективность УФ-спектроскопии и методов гибридизации. Несмотря на множество преимуществ применения наночастиц из оксида кремния, существует целый ряд требующих решения сложностей, таких как разработка методов крупномасштабного малозатратного производства, а также биосовместимость после биомолекулярного контакта. Решение этих вопросов обеспечит возможность превращения наноматериалов на основе оксида кремния в компоненты современных биосенсоров. Не имеющие проводов и электродов биосенсоры на основе микровесов на кристалле кварца представляют собой еще одну платформу для анализа взаимодействий между биомолекулами с высокой чувствительностью. Пульсации кварцевых осцилляторов возбуждаются и регистрируются с помощью антенн через электромагнитные волны без проводных соединений. Это точное бесконтактное изменение является ключевым моментом для разработки ультравысокочувствительной идентификации белков в жидкости с помощью измерительных приборов на основе биосенсоров на кристаллах кварца. Уникальные характеристики материалов на основе оксида кремния, кварца или стекла позволили разработать несколько новых высокотехнологичных биосенсоров для усовершенствования измерительных приборов, применяемых в области биомедицинских технологий, однако их экономическая целесообразность и биологическая безопасность требуют внимания.

Биосенсоры на основе наноматериалов

Для иммобилизации биосенсоров используется широкий спектр наноматериалов, в том числе наночастицы золота, серебра, оксида кремния и меди, а также материалы на основе углерода, такие как графит, графен и углеродные нанотрубки. При разработке электрохимических и других биосенсоров материалы на основе наночастиц обеспечивают высокую чувствительность и специфичность. Среди металлических наночастиц для практического использования наиболее пригодны золотые наночастицы, устойчивые к окислению и практически нетоксичные. В то же время наночастицы из других металлов, таких как серебро, при введении в организм, например, для доставки препаратов, окисляются и оказывают токсичное действие. В целом применение наноматериалов в составе биомедицинских биосенсоров ассоциировано с потенциальными сложностями. Более того, стратегии усиления сигнала с помощью наночастиц имеют потенциальные преимущества и недостатки. Тем не менее, наноматериалы считаются важными компонентами биоаналитических устройств благодаря их способности повышать чувствительность и пороги обнаружения при детектировании единичных молекул. В данном контексте стоит упомянуть изобретение наночастиц на основе платины для электрохимической амплификации с одноуровневой реакцией для выявления низкой концентрации ДНК. Аналогичным образом полупроводниковые квантовые точки и нанокристаллы из оксида железа, обладающие как оптическими, так и магнитными свойствами, можно эффективно связывать с опухолеспецифичными лигандами, такими как моноклональные антитела, пептиды или малые молекулы, для прицельного воздействия на опухолевые антигены с высокой аффинностью и специфичностью. Технология квантовых точек может применяться в изучении опухолевого микроокружения при проведении терапии, а также для доставки нанопрепаратов.

Генетически закодированные или синтетические флуоресцентные биосенсоры

Разработка меченых биосенсоров с использованием генетически закодированной или синтетической флуоресценции предоставила возможность изучать биологические процессы, в том числе различные молекулярных пути внутри клетки. Фактически метод выявления меченых флуоресценцией антител впервые был разработан для получения изображений фиксированных клеток. Эта стратегия предоставила новые возможности разработки таких биосенсоров с использованием биологических белков и малых молекул, связывающихся с аналитами и вторичными мессенджерами. Впоследствии были разработаны флуоресцентные биосенсоры для анализа двигательных белков, использующие метод выявления единичных молекул при определенной концентрации аналита. Несмотря на эти преимущества, методология выявления и анализа метки выглядит сложной. Изобретение зеленого флуоресцирующего белка и других флуоресцирующих белков предоставило ряд преимуществ с точки зрения дизайна и эффективности оптического зонда. За последнее десятилетие генетически закодированные биосенсоры, специфичные к молекулам, вовлеченным в синтез энергии, активным формам кислорода и цАМФ, позволили лучше разобраться в физиологии митохондрий. цАМФ является важной сигнальной молекулой и терапевтической мишенью для сердечно-сосудистой системы. С учетом этого биосенсоры, функционирующие на основе метода резонансного переноса энергии флуоресценции, были разработаны для визуализации цГМФ, цАМФ и ионов кальцию внутри клетки. Некоторые из таких сенсоров эффективно применяются для in vivo визуализации в первичных культурах и живых клетках. На сегодняшний день проработано достаточно много аспектов разработки сенсоров для визуализации в условиях живого организма. Появившиеся в результате оптимизации таких подходов малоугловое рассеяние рентгеновский лучей для разработки кальциевых каналов и резонансный перенос энергии флуоресценции для выявления киназ признаны самыми лучшими биосенсорными методиками в современной физиологии. Таким образом был разработан ряд специфичных к определенным мишеням биосенсоров на основе микроорганизмов (микробов) и клеточных органелл. Как объяснялось ранее, электрохимические, электромеханические и оптические биосенсоры разрабатываются для более эффективного, по сравнению с другими молекулярными методиками, выявления миРНК. Появление in vivo визуализации с помощью биосенсоров малых молекул обеспечило возможность лучше разобраться в клеточной активности и механизмах действия многих других молекул, в том числе ДНК, РНК и миРНК. На сегодняшний день для трансформации в данной области требуется полногеномный подход, подразумевающий применение более эффективных генетических биосенсоров на основе оптики. На современном этапе считается, что оптические биосенсоры, комбинирующие технологии флуоресценции и малых молекул/наноматериалов, позволяют добиваться лучших результатом с точки зрения применимости и чувствительности.

Микробные биосенсоры, разработанные с помощью синтетической биологии и генетической/белковой инженерии

Более поздняя тенденция в области мониторинга состояния окружающей среды и биоремедиации (биологической очистки) подразумевает применение последних инновационных технологий, основанных на генетической/белковой инженерии и синтетической биологии, для программирования микроорганизмов, наделяя их специфичными выходными сигналами, чувствительность и избирательностью. Например, живые клетки, обладающие ферментативной активностью, обеспечивающей деградацию ксенобиотических соединений, будут иметь широкое применение в биоремедиации. Также были разработаны биосенсоры на микробном топливе для мониторинга биохимической потребности в кислороде и токсичности в окружающей среде. Бактерии обладают потенциалом деградировать органический субстрат и генерировать электричество для ферментации. По сути технология заключается в использовании биоэлектрохимического устройства, регулирующего силу микробного дыхания для конвертации органических субстратов непосредственно в электрическую энергию. Несмотря на эти возможности, ограничения применения микробных биосенсоров обусловлены низкой удельной мощностью с точки зрения себестоимости и эксплуатационных расходов. Специалистам удалось значительно улучшить производительность и снизить затраты с помощью новых системных подходов, что позволило создать на основе этих технологий платформу для разработки обладающих заданными свойствами микробных биосенсоров с автономным источником питания. Еще одной областью использования микробных биосенсоров является их применение для обнаружения пестицидов и тяжелых металлов, при котором эукариотические микроорганизмы имеют преимущество перед прокариотами. Это преимущественно обусловлено преимуществом разработки цельноклеточных биосенсоров для выявления токсичности пестицидов и тяжелых металлов с высокой избирательностью и чувствительностью. Помимо этого более сложные эукариотические микроорганизмы могут обладать более широким спектром чувствительности к различным токсичным молекулам и имеют большее сродство к высшим животным. Микробные биосенсоры имеют широкий спектр применения, начиная от мониторинга окружающей среды и заканчивая производством энергии. В будущем такие микробные биосенсоры будут иметь более широкое применение в мониторинге загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами и экоэффективном производстве электроэнергии.

Продолжение: Технологическое сравнение биосенсоров.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru

15.06.2017