Цветные метки для биологов
Флуоресцентные белки
Дмитрий Чудаков, ПостНаука
Флуоресценция – это не люминесценция, это не свойство существ или веществ – светиться самостоятельно в темноте. Флуоресценция – это способность поглотить свет на определённой длине волны и, с задержкой в несколько наносекунд, испустить его на чуть большей длине волны. Например, поглотить фиолетовый свет, испустить зелёный; поглотить жёлтый, испустить оранжевый; поглотить оранжевый, испустить красный. Таких флуоресцентных красителей в мире существует множество, их можно синтезировать химически, и с ними делается масса полезных практических приложений, однако мы сегодня будем говорить о генетически кодируемых флуоресцентных метках.
Флуоресцентные белки, которые, будучи белками, генетически кодируемы, происходят на свет путём синтеза белковой последовательности, закодированной в участке ДНК. Такие гены, и, соответственно, такие белки встречаются в различных морских организмах: в медузах, в коралловых полипах, мягких и твёрдых, в рачках, в ланцетниках (хордовых) – но встречаются они почему-то только в море.
Они могут быть различных цветов: зелёные, красные, жёлтые, синие.
Их можно совершенствовать, и учёные во всём мире работают над тем, чтобы разработать более яркие или более быстро созревающие, или более устойчивые к обесцвечиванию флуоресцентные белки (также, как и любой краситель, они при интенсивном и продолжительном облучении выгорают, и это мешает исследователям в их работе).
Таким образом, речь идёт не об одном каком-то флуоресцентном белке, а о множестве разных вариантов, природных и разработанных позднее учёными – во всём мире множество лабораторий работает в этом направлении. Вы можете взять участок, кодирующий флуоресцентный белок, небольшой ген в 700 нуклеотидов, и физически перенести его в другой организм, в бактерию, в линию эукариотических клеток, в трансгенную мышь, лягушку, зверюшку – в кого угодно. И далее этот организм, эта живая система своими собственными клетками будет использовать этот генетический материал и сама вырабатывать флуоресцентный белок, фактически, сама себя метить.
Это свойство даёт в руки исследователям необозримые возможности. Вы можете сделать трансгенный организм и пометить его целиком, но, так как ген всегда можно поместить в окружение, которое будет определять его активность более специфическим образом, то возможности сразу открываются более широкие. Например, вы можете поставить ген флуоресцентного белка под промотер, который активен в клетках определённого типа, и ваша трансгенная мышка будет флуоресцировать не вся, а только, например, клетки печени. Вы можете поставить ген флуоресцентного белка под такой промотер, который активен, например, на определённой стадии развития, и маркировать стадии развития живого организма.
Можно ген флуоресцентного белка добавить рядом с геном, кодирующим какую-то другую пептидную последовательность, и получить то, что называется химерный белок (белок-слияние), в котором с конструкции ДНК будет считываться не просто флуоресцентный белок, а флуоресцентный белок, несущий на себе ещё дополнительную пептидную последовательность, которая, например, направляет его в митохондрии или в ядро, или на мембрану клетки, или на мембрану клетки в определённых условиях. В определённых условиях он будет мигрировать, в ответ на какие-то внешние раздражители, с мембраны в цитоплазму или в ядро.
Можете получить белок-слияние с любым вашим белком интереса с сохранением его функциональной активности, то есть в результате в клетке ваш исследуемый белок, который что-то делает, как-то расположен, будет помечен флуоресцентным красителем, и клетка будет сама эту конструкцию производить. Так как цветовых вариантов много, то вы можете пометить множество белков, осуществить многоцветное мечение и посмотреть, как они взаиморасположены в живой клетке, и как их расположение меняется по ходу жизни клетки в ответ на какие-то внешние раздражители.
Можно (и это более сложное и сегодня активно развивающееся направление) делать очень точным и конкретным образом жёстко слитые конструкции, состоящие из флуоресцентного белка и каких-то чувствительных доменов, например связывающих ионы кальция, и методом продолжительной генно-инженерной работы собирать такие конструкции, которые в ответ на связывание ионов кальция этими доменами способны так изменять свою конформацию (и в результате конформацию флуоресцентного белка в части микроокружения хромофора, которое определяет его флуоресцентные свойства) что флуоресцентный сигнал будет меняться в разы и даже в десятки раз. И это огромное поле, которое только начинает развиваться, но первые (и совершенно фантастической красоты) успехи уже получены.
Нейробиологи всегда хотели иметь возможность следить за активностью клеток нервной системы, как они обмениваются сигналами, и кто из них в каком порядке возбуждается. И вот такие генетически кодируемые кальциевые сенсоры сегодня позволяют делать совершенные чудеса: вы можете в живой рыбке фактически видеть, как она думает, как у неё по нейронам бегает сигнал. Это просто видно, это непонятно, с этим надо дальше разбираться, но тот факт, что это видно, это уже совершенно потрясающая красота. Также нейробиологи использовали и многоцветное мечение. Они применили такую систему, как комбинаторное мечение, комбинаторика в цветовых вариантах флуоресцентных белков, то есть, в различных нейронах, во множестве нейронов, в каждом из них происходит индивидуальное событие или комбинация, которая случайным образом приводит к сборке, например двух генов красного флуоресцентного белка, одного зелёного, трёх синих. И вот таких комбинаций соотношения числа генов множество, они дают тысячи оттенков, глазами их, может быть, различить и сложно, но с помощью компьютерных методов это сделать можно, и прослеживать окончания нейронов, их хитросплетений, как они расползаются, кто с кем взаимодействует. Это, наверное, очень мощный инструмент для нейробиологов, но кроме того, это потрясающе красиво. Эта технология называется brainbow, это удивительные просто произведения искусства.
Флуоресцентный белок в конструкции с вашим белком-слияния может интересовать вас не только как статичный мАркер, где расположен ваш белок, но вам может быть интересно посмотреть, с какой скоростью и куда он перемещается, это тоже можно делать. Можно обесцветить флуоресцентный белок мощным облучением в одной части клетки и посмотреть, с какой скоростью не обесцвеченный туда притечёт. А есть фотоактивируемые флуоресцентные белки. Это такие белки, которые могут свои характеристики менять в ответ на облучение; они могут превращаться, например, из не-флуоресцентных в ярко-красно-флуоресцентные или из зелёных в красные, или из синих в зелёные. В частности, вы можете в одном участке клетки, «зажечь» флуоресцентный сигнал определённого цвета и посмотреть, с какой скоростью и куда он будет распространяться. Также вы можете отметить конкретные группы клеток и посмотреть, как они будут расползаться в ткани, которые вы исследуете.
Отдельное направление, тоже очень интересное и активно развивающееся, это мечение клеток в толще живых тканей. Можно осуществлять его с использованием разноцветных вариантов, но лучше всего осуществлять это через живые ткани, ввиду характеристик поглощения кожи, гемоглобина, лучше всего проницает то, что называется дальне-красное излучение, это длинноволновая часть видимого спектра, и ближний, инфракрасный диапазон, который мы глазом не видим. В природе флуоресцентных белков такого типа не существовало, зачем-то они не были нужны живым организмам, которые для каких-то своих внутренних нужд придумывали, эволюционировали в них эти флуоресцентные белки.
Множество групп работали над тем, чтобы получить как можно более дальне-красные флуоресцентные белки, но при этом, достаточно яркие и быстро созревающие, и низкотоксичные, чтобы можно было метить живые ткани и в интактной мыши, на мышиной модели отрабатывать разные вещи, в первую очередь, в области онкологии. То, что называется перевиваемые опухоли, вы можете подсадить клетки, стабильно экспрессирующий дальне-красный флуоресцентный белок, и следить за тем, как эта опухоль развивается, отследить, как воздействуют те или иные терапевтические подходы. Есть в этой области и значительно более сложные модели, всё это уже работает вживую, и это используют как учёные, так и фармацевты в своей ежедневной работе.
Например, у вас есть два типа опухолевых клеток, а опухоль это редко один тип клеток, это, на самом деле, может быть сложное сочетание разных вариантов, у вас, зачастую, это комбинация нескольких типов, которые друг от друга зависят, и вы можете визуализировать один тип клеток красным флуоресцентным сигналом, другой – зелёным флуоресцентным сигналом, а ещё вы можете визуализировать взаимодействие, например, лиганда и рецептора, где они соприкасаются, потому что опять флуоресцентные белки могут быть использованы, и для этого есть так называемые варианты сплит-флуоресцентных белков. Вы берёте один ген, разделяете на две части, две половинки флуоресцентного белка, сами по себе не способные к флуоресценции – только там, где они встретят друг друга, они свернутся, созреет хромофор и появится флуоресцентное свойство, это тоже можно отслеживать. Дальше этот перечень можно продолжать практически бесконечно, множество и множество красивых технологий.
Есть технологии, которые позволяют пометить клетки в зависимости от того, на какой стадии деления они находятся, зелёным или красным флуоресцентным сигналом с использованием флуоресцентных белков, с мотивами, которые приводят к их быстрой деградации в разные фазы клеточного цикла. И на живом срезе ткани вы можете видеть, какие клетки у вас сейчас активно делятся, а какие не делятся. Это уже фантастической красоты и наглядности инструмент для того, чтобы исследовать разные процессы.
Ясно, что прогресс в этой области ещё возможен, хотя, есть и другие, альтернативные технологии, которые позволяют создать в том или ином виде генетически кодируемые варианты, приводящие к возникновению флуоресцентного сигнала. Ну и просто «палитра» хороших, ярких вариантов для многоцветного мечения ещё до конца не завершена, то есть, ещё на 5 – 10 лет есть работа для тех лабораторий, которые в этом направлении работают. И, тем не менее, можно сказать, что, пожалуй, основная, важнейшая часть была сделана за последние 10 лет. И Нобелевская премия, которая в 2008 году была вручена именно за открытие флуоресцентных белков и разработку на их основе вариантов, подвела, в значительной степени, некую черту под тем, что основа положена. Уже сегодня мы можем увидеть множество реально работающих инструментов, которые пошли в практику в исследованиях фундаментального характера, во множестве фармацевтических компаний, работающих в биомедицине над теми или иными клеточными технологиями, скринингом лекарственных препаратов. Другими словами открытие, разработка и переход в практику действительно состоялись, и сегодня уже можно брать и работать, и делать удивительные вещи.
Автор – доктор биологических наук, руководитель подразделения лаборатории геномики адаптивного иммунитета
Отдела геномики и постгеномных технологий Института биоорганической химиии РАН.
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru
16.05.2013