Нобелевская премия по химии 2014 г.: подробности

Микроскопия без берегов

Алексей Левин, «Элементы»

Общее число лауреатов Нобелевской премии по химии заметно меньше, чем в двух других естественнонаучных номинациях. С 1901 по 2013 год она присуждалась 106 раз 169 ученым (причем не все они были химиками). В 2014 году к ним прибавились трое лауреатов, награжденных «за разработку флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения». Интересно, что все они занимают и административные должности. Это руководитель химического факультета Стэнфордского университета Уильям Мёрнер (William E. Moerner), заведующий лабораторией в исследовательском кампусе Медицинского института Говарда Хьюза в штате Вирджиния Эрик Бетциг (Eric Betzig) и уроженец Румынии Штефан Хелль (Stefan Hell), директор Института биофизической химии Общества Макса Планка в Гёттингене и заведующий отделением в Немецком центре по изучению рака (DKFZ) в Гейдельберге.

Лауреаты Нобелевской премии по химии 2014 года
(слева направо: Эрик Бетциг, Штефан Хелль, Уильям Мёрнер).
Изображение с сайта nobelprize.org

Работы новых лауреатов лежат на стыке биохимии, физической оптики и молекулярной биологии. Они привели к появлению двух новых методов оптической микроскопии, позволивших преодолеть так называемый дифракционный предел микроскопических наблюдений, который в 1870-80 годах установил (сначала экспериментально, а после и теоретически) немецкий физик Эрнст Карл Аббе. Аббе показал, что волновая природа света не позволяет до бесконечности улучшать разрешающую способность оптических приборов. В частности, из его работ следует, что минимальный размер деталей, доступных наблюдению в классический оптический микроскоп, равен частному от деления половины длины световой волны на коэффициент преломления среды, которая заполняет пространство между объективом микроскопа и объектом наблюдения. На практике этот коэффициент обычно не превышает 1,5-1,6, и потому предел разрешающей способности микроскопа соответствует одной трети длины световой волны. Поскольку человеческий глаз не воспринимает волны короче 380-400 нанометров, возможности стандартной оптической микроскопии ограничены наблюдением объектов, размеры которых превышают 130-140 нанометров. Этого достаточно для бактерий, клеток и даже крупных клеточных органелл, таких как митохондрии, но слишком мало для микроскопического исследования вирусов, не говоря уже о белковых молекулах.

В 1980-90 годы ученые нашли ряд возможностей улучшить разрешение оптических приборов, применяемых для исследования микромира. Конфокальные и мультифотонные (Multiphoton microscopy) системы позволили уменьшить минимальный размер различимых объектов примерно вдвое, а сканирующие микроскопы ближнего поля – даже десятикратно. Однако микроскопия ближнего поля имеет много ограничений и не может претендовать на широкую применимость. Две технологии оптической микроскопии, отмеченные Нобелевской премией, не только обеспечивают сверхвысокое разрешение, но и могут применяться для наблюдения большого разнообразия объектов. Благодаря им и другим подобным методам оптическая микроскопия быстро превращается в наноскопию.

Обе технологии используют опорные сети, состоящие из светящихся молекул. Такие сетки создаются и работают по-разному, но в обоих случаях их элементы регистрируются независимо друг от друга. Поэтому информация с сеток считывается без оглядки на дифракционный предел, что и делает новые методы практически универсальными.

Метод Штефана Хелля основан на так называемом стимулированном истощении эмиссии (Stimulated Emission Depletion, STED). Исследуемый объект метят молекулярными маркерами, способными испускать световые кванты (флуоресцировать) под действием лазерного излучения (таким объектом может быть молекула ДНК, а метками – флуоресцентные антитела). Однако эти же молекулы можно заставить испускать с некоторой задержкой и фотоны с большей длиной волны, если облучить их другим лазером с должным образом подобран ыми характеристиками. Пусть первый лазер создает на поверхности образца круглое световое пятно, а лучи второго фокусируются в кольце, накрывающем весь этот круг кроме центра. Метки в центральной зоне будут светиться на одной длине волны, а метки внутри кольца – на другой, гораздо большей (это и есть истощение флуоресцентной эмиссии). Если настроить приемную систему микроскопа на регистрацию лишь коротковолновых фотонов, участки с истощенной эмиссией как бы погаснут.

Эту систему можно превратить в сканирующий микроскоп, если направлять лазерные лучи в разные участки объекта, регистрировать сигналы от светящихся зон и обрабатывать на компьютере. Если метки плотно покрывают поверхность объекта, то картинки, полученные в ходе такого сканирования, воспроизведут его структуру. Степень разрешения такого прибора определяется размерами зон с неподавленной эмиссией, которые в принципе могут быть даже нанометровыми.

Хелль разработал теорию своего метода в 1993-94 годах, а в 1999 году продемонстрировал его на практике. Сначала технология STED была немногим лучше конфокальных микроскопов. Сейчас на заводских приборах она обеспечивает разрешение от 30 до 80 нанометров, а в эксперименте – два с половиной нанометра.

Фотография одного и того же объекта конфокальным микроскопом (слева) и STED-системой (справа).
Длина масштабной линейки 1 мкм, длина масштабных линеек во врезах 250 нм
(из статьи Benjamin Harke et al., 2008. Resolution scaling in STED microscopy).

Второй метод называется PALM, Photoactivated Localization Microscopy. Его главным разработчиком признан Эрик Бетциг (хотя почти такой же вклад внес и его коллега по Институту Хьюза Харальд Гесс (Harald F. Hess)). Впервые эта технология была продемонстрирована в 2006 году. Третий лауреат, Уильям Мёрнер, оптической микроскопией не занимался. Однако PALM использует белки, которые под действием синего или ультрафиолетового света испускают яркое зеленое свечение. Эти так называемые зеленые флуоресцентные белки (Green fluorescent protein, GFP) были впервые выделены из тканей медуз вида Aequorea victoria, а позднее найдены и у других морских беспозвоночных (их открытие было отмечено Нобелевской премией по химии 2008 года). Мёрер в 1989 году первым в мире изыскал возможность измерить поглощение света одной-единственной молекулой, а через 8 лет открыл способ управлять флуоресценцией отдельных GFP-молекул с помощью лазерного излучения.

Открытием Мёрнера воспользовались Бетциг с коллегами для разработки технологии PALM. Она основана на использовании лазерного излучения с длиной волны, необходимой для возбуждения зеленых флуоресцентных белков. Образец многократно облучают очень слабыми лазерными импульсами, содержащими небольшое число фотонов. Эти фотоны заставляют светиться белковые молекулы – опять таки, в малом количестве. Поскольку свет случайным образом выбирает эти молекулы на поверхности объекта довольно большой протяженности, почти все они о казываются отделенными друг от друга расстояниями, превышающими предел Аббе. Положение каждого светящегося центра можно зарегистрировать с большой точностью с помощью оптического микроскопа. По отдельности такие картинки не слишком информативны, однако компьютерный анализ всех изображений, который делается на основе вероятностных алгоритмов, позволяет восстановить структуру исходного образца. Сегодня PALM обеспечивает разрешение вплоть до 20 нанометров, и, скорее всего, это еще не предел.

Изображение актинового цитоскелета живой клетки.
Центральная часть изображения сделана по технологии PALM.
Рисунок с сайта cfn.kit.edu

В заключение стоит отметить, что STED и PALM – отнюдь не единственные системы оптической супермикроскопии, однако именно на них упала благодать Нобелевской премии. Почему именно – тайна сия велика есть.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru
20.10.2014