Подписаться на новости
  • Сенатор
  • ООО "Ай Вао"
  • Vitacoin

Ричард Хендерсон: Нобелевская премия по химии

Henderson.jpg

Лауреат Нобелевской премии по химии 2017 года рассказал об электронной криомикроскопии

ПостНаука

Электронная криомикроскопия позволяет более эффективно использовать возможности такого лабораторного инструмента, как электронный микроскоп. Об этом невозможно было бы даже подумать до открытия электронов, которое совершил в начале XX века Джозеф Томсон – недавно мы праздновали столетие открытия электрона. И как только стало известно, что благодаря корпускулярно-волновому дуализму электроны можно было бы фокусировать так же, как волны света, у Эрнста Руски возникла идея создания электронного микроскопа. Его огромное преимущество заключается в том, что длина волны освещающего поля электронов в сотню тысяч раз меньше, чем аналогичная характеристика пучка света. Если длина волны света составляет 1 микрометр, то длина волны электронов измеряется пикометрами.

В принципе, это позволяет получить гораздо большее разрешение, но техническая сторона этого вопроса была сопряжена с множеством трудностей. Только в 1950–1960-е годы удалось получить разрешение электронного микроскопа на уровне атомов. В применении этой технологии биологи всегда оставались как бы позади, потому что исследователи применяли ее в основном для изучения металлов. Причина этого заключается в том, что при наведении пучка электронов на биологический объект, состоящий из органических молекул, структура этого объекта разрушается радиационным воздействием. Во всех первых попытках применения электронной микроскопии для изучения биологических объектов образцы были уничтожены. И поэтому изначально все методы применения электронной микроскопии для решения биологических задач заключались в том, чтобы внедрить в биологические структуры тяжелые металлы, подражая металлургам и другим исследователям из области наук о материалах.

Такое положение дел сохранялось, пока за исследования не взялся американский ученый Боб Глезер, по сей день работающий в Беркли. Он указал на повреждения от радиации. Это означает, что электроны, проходя сквозь образец, ломают связи и меняют его структуру, превращая его из белков, липидов и так далее в сожженный продукт. В структуре повреждаются атомы водорода, они выделяются в виде газа, и исследователю остаются лишь остатки от первоначальной структуры. Глезер обратил внимание на то, что невозможно определить структуру отдельных молекул из-за воздействия радиации. И он предложил использовать кристаллы, чтобы исследовать, как эти структуры взаимодействуют с электронами.

Если у вас есть структура, состоящая из десяти тысяч молекул, вы можете получить данные о ней, даже если уничтожите несколько молекул. Глезер и его студенты в Беркли были первыми, кто проверил гипотезу о том, что преодолеть или снизить ущерб от радиации можно путем охлаждения образца. И они охлаждали экспериментальные образцы до −100 °C. Это нижний предел, до которого можно было дойти, поскольку у электронных микроскопов были очень плохие вакуумные камеры и они могли загрязняться.

Только в 1980 году появились более совершенные вакуумные камеры, холодные предметные столики (для охлаждения образца до низких температур), которые позволили достичь температуры жидкого азота. Это сделали в европейской лаборатории молекулярной биологии Жака Дюбоше в Гейдельберге. Там на протяжении трех-пяти лет изучали свойства воды, в норме являющейся окружающей средой для всех биологических структур. Было показано, что при замораживании вода образует кристаллы льда, иногда гексагональные, иногда кубические, но, если заморозить воду очень быстро, она образует аморфный лед. И Жак Дюбоше разработал метод, позволяющий сделать тонкую пленку льда при помещении образца в определенные условия. Изначально для этих целей пытались использовать жидкий азот, но из-за того, что его температура была близка к точке кипения и получался газ, охлаждение было слишком медленным, и образовывались кристаллы.

Сейчас используется другой подход, который также изобретен Жаком Дюбоше. Он заключается в охлаждении жидкого этана или пропана до температуры жидкого азота, но они при этом остаются жидкостями. Когда жидкий этан находится в своей точке замерзания и вы наслаиваете на него тонкую пленку воды, существует разрыв в 100 °C между точкой замерзания и точкой кипения жидкого этана. Это и превращает воду в очень тонкую пленку аморфного льда.

Я думаю, что настоящее начало эры криомикроскопии связано с работами Дюбоше. В то время мы работали над двухмерными кристаллами белка, который называется бактериородопсин. Мы работали при комнатной температуре, а охлаждая образцы до температуры жидкого азота, мы могли бы получить в 4–5 раз больше информации до того момента, как будет достигнут уровень повреждения радиацией. То есть охлаждение образцов не спасает от действия радиации, но замедляет наступление последствий в 4–5 раз. И поэтому мы применяли криомикроскопию, чтобы определить структуру 2D-кристаллов.

Настоящая сила электронной криомикроскопии заключается в том, что возможно заморозить все что угодно: кусочки ткани, растворы молекул, суспензии вирусов, можно замораживать рибосомы, фактически любой объект. Сейчас в электронной криомикроскопии используется четыре-пять разных подходов к разным типам образцов, каждый из которых по-своему интересен и проливает свет на разные сферы биологического знания.

Проще всего замораживать суспензию одиночных частиц. Например, если взять рибосомы – места синтеза белка – из разных типов клеток, можно заморозить тонкую пленку с рибосомами и увидеть все рибосомы по отдельности, запечатленные в разных положениях. Можно выбрать рибосомы, если они представлены в достаточном количестве, 10 или 20 тысяч, усреднить все ракурсы и сделать 3D-модель структуры.

Такой же принцип действует и в томографии, когда, например, у пациента обнаружена опухоль мозга и он идет на обследование. Проводят рентгеновское облучение с шести различных углов, и восстанавливается 3D-картинка мозга, глаз и опухоли. В структурной биологии мы делаем то же самое с применением электронной криомикроскопии. Можно исследовать одиночные частицы, не имеющие какой-либо симметрии, но нужно получить изображения со всех возможных ракурсов.

Другой тип образцов в структурной биологии – это в той или иной степени симметричные образцы. Например, у многих вирусов сферические частицы с икосаэдральной симметрией. Это значит, что есть двойные, тройные и пятеричные оси симметрии, которые проходят через частицу, а в каждой икосаэдральной частице содержится 60 копий, 60 различных ракурсов. Можно получить изображение икосаэдральной частицы с одного ракурса, но на самом деле в этом случае вы будете смотреть на частицы, которые образуют этот вирус, с 60 различных углов. Таким образом, чтобы построить 3D-модель структуры этого вируса, потребуется в 60 раз меньшее число изображений, чем для несимметричной частицы того же размера.

Также можно разрешать множество структур в биологии, имеющих спиральную организацию, например альфа-спираль актиновых филаментов, которые образуют мышечную ткань. В мышцах есть тонкие и толстые филаменты, они создают натяжение в противоположные стороны, и мышца сокращается. Это можно хорошо изучить с помощью электронной криомикроскопии: увидеть спиральные нити, получить изображения и усреднить их. Выводя среднюю структуру, нужно учитывать разную геометрию: для одиночных частиц необходимо точно определить ориентацию, для спиралей существует предсказанное геометрическое расположение одной субъединицы относительно другой.

Следующий по сложности уровень организации – это двумерные кристаллы, в изучении которых применяется один слой, где есть одно направление для одной оси и другое для a- и b-осей, и это называется электронной кристаллографией. Первоначально это направление было более простым, потому что один кристалл может состоять из 10 тысяч молекул, находящихся в одной ориентации.

В итоге от спиралей из одиночных частиц или двумерных кристаллов можно перейти к изучению общих структур. В этом случае ученые применяют электронную криотомографию. Это означает, что один образец, в котором нет повторяющихся и кратных структур, необходимо сфотографировать с разных ракурсов с шагом плюс-минус 70 градусов и сделать томограмму, совсем как в случае с опухолью мозга. И таким способом можно изучать целый спектр различных образцов.

Используя эти методы, исследователи смогли разрешить структуры сотен и тысяч различных молекул, которые не удавалось расшифровать другими методами, например рентгеноструктурной кристаллографией или ЯМР-спектроскопией. За последние три года произошло значительное техническое усовершенствование, компьютерные программы стали более мощными, и практически появилось новое поколение прямых электронных детекторов. Вместо того чтобы применять пленки, сейчас мы можем использовать новое твердое состояние в устройствах, основанных на кремнии. Это улучшает соотношение «сигнал – шум» при получении изображений. Так что сейчас мы живем в эпоху революции в разрешении, как назвал это Вернер Кюльбрандт в 2014 году.

До 2010 года можно было получать большие структуры с высоким разрешением, маленькие структуры, но они были похожи на капли или кляксы. Биологи, занимающиеся электронной криомикроскопией, несколько унизительно назывались блобологами (от англ. blobs – «кляксы»), но сейчас наступили времена революции в разрешении, и все структурные биологи стремятся к использованию электронной криомикроскопии. Сегодня это стало очень мощным методом, и люди, у которых нет никакого опыта в электронной криомикроскопии, входят в эту научную отрасль. Все больше исследовательских подразделений, университетов, исследовательских институтов инвестируют в электронную криомикроскопию. Сейчас уже не хватает специалистов, чтобы обслуживать все возможные направления, которые хотелось бы развить. Поэтому мы можем сказать, что электронная криомикроскопия стала очень мощным методом, возможно, наиболее важным в структурной биологии.

Об авторе:
Richard Henderson – Professor of Molecular Biology, University of Cambridge.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru


Читать статьи по темам:

премия биомолекулы визуализация Версия для печати
Ошибка в тексте?
Выдели ее и нажми ctrl + enter
назад

Читать также:

Нобелевская премия по химии

Ее получат Ж.Дюбоше, Й.Франк и Р.Хендерсон – «за развитие криоэлектронной микроскопии для определения структуры молекул с высоким разрешением в растворе».

читать

«Нобелевка» по (био)химии

В этом году Нобелевскую премию по химии получили Мартин Карплус, Майкл Левитт и Арье Уоршел «за создание многоуровневых моделей сложных химических систем» – в т.ч. белков и ДНК.

читать

Наноприз размером в три миллиона

Академик РАН Сергей Лукьянов получит премию Rusnanoprize за методику получения разноцветных флуоресцентных белков. Но все равно за державу обидно: лауреатом премии за коммерциализацию его разработок стала американская компания.

читать

Нобелевскую премию по химии получат молекулярные биологи

Роберт Лефковиц и Брайан Кобилка сделали основополагающие открытия, объяснившие, как работает один из важных классов клеточных рецепторов – рецепторов, сопряженных с G-белком.

читать

Палладиевая Нобелевская премия по химии

Нобелевскую премию по химии в 2010 году дали за разработку методик палладиевого катализа, позволяющих точно «сшивать» атомы углерода и ситезировать вещества, приближающиеся по своему строению и свойствам к природным молекулам.

читать