Сейте разумно!

Упорядоченный посев и пуассонер – высокоточная техника количественной микробиологии

Журнал «Медицина XXI век» № 2-2008, с. 92-97

Н. Н. Хромов-Борисов¹, Jenifer Saffi², João A. P. Henriques^2
1Кафедра физиологии Медицинского факультета Санкт-Петербургского государственного университета.
Эл. почта: Nikita.KhromovBorisov@gmail.com
²Centro de Biotecnologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil.
E-mail: jenifer@orion.ufrgs.brиpegas@cbiot.ufrgs.br

Введение

Качество исходных («сырых») данных есть одно из основополагающих и желательных требований Надлежащей Лабораторной Практики (GLP) и Надлежащей Статистической Практики (GSP). В количественной микробиологии это означает, что подсчеты клеток и (или) колоний должны подчиняться «идеальному» пуассоновскому распределению [1]. Со времен классических работ Стьюдента [2] и Фишера и др. [3] стало очевидно, что при «идеальных условиях» подсчеты клеток, производимые при помощи гемоцитометра (камеры Горяева) или подсчеты колоний на чашках Петри варьируют в соответствии с распределением Пуассона. Когда эти условия выполнены, то вычисленное среднее значение является непосредственной мерой плотности в изучаемой микробной популяции, и такие оценки являются наиболее точными. «Любое значимое отклонение от теоретического распределения [распределения Пуассона – НХ] является сигналом к тому, что оценка среднего значения может оказаться совершенно ненадежной» [3].

Современные исследования показывают, что подсчеты колоний микроорганизмов на чашках Петри, производимые, например, в генетической токсикологии (тест Эймза) [4‑6] или при контроле качества пищевых и лекарственных продуктов [7] слишком часто (в более чем 50% случаев) проявляют существенное экстрапуассоновское варьирование с чрезмерно повышенной дисперсией (overdispersion). Это явление остается серьезнейшей проблемой в количественной микробиологии. Специалисты по аналитической статистике пытаются решать эту проблему, изобретая изощренные вероятностно-статистические модели и соответствующие критерии для выявления этого явления. Однако введение дополнительных параметров в такие модели усложняет анализ данных и снижает его эффективность и надежность (см., например, работы [5-8] и ссылки в них). Проблема настолько серьезна, что германские микробиологи и статистики предложили ввести непуассоновские модели в национальные стандарты GLP по микробиологическому (эпидемиологическому) контролю безопасности и качества пищевых и лекарственных продуктов [7].

Одной из основных причин этого может быть низкая точность традиционных методов посева микробных клеток в чашки Петри. Традиционно наиболее распространенными являются следующие два метода посева:

Небольшие объемы (капли) клеточной суспензии микробных клеток с помощью пипетки (дозатора) вносятся на поверхность среды в чашке Петри и как можно более равномерно распределяются по этой поверхности с помощью изогнутой стеклянной палочки (шпателя).

Слой основного питательного агара заливают тонким слоем расплавленного полужидкого агара со взвесью микробных клеток [9].

Для обеспечения таких «идеальных условий», которые обеспечивают практически одинаковый размер микробных колоний или распределение Пуассона для их численности в 1973 г. были изобретены специальная техника посева, названная «упорядоченным посевом» и устройство, названное «пуассонером» [10,11]. Cтого времени они используются в нескольких лабораториях в России, в США, в Великобритании и в Бразилии [10-24]. Более всего они популярны у молекулярных генетиков, которым нужны точные оценки частот мутаций, рекомбинации, трансформации, выживаемости и т.п.

Долгое время этот метод и устройство были лишь кратко описаны на английском языке в обзоре по методам измерения частоты спонтанных мутаций у дрожжей, опубликованном в 1978 г. [13,14]. Остальные описания были опубликованы по-русски – в трех тезисах [10-12], в кандидатской диссертации Н.Н. Хромова-Борисова [15] и в учебнике С.Г. Инге-Вечтомова «Генетика с основами селекции» ([16], с. 299-302). Метод излагается в лекциях и демонстрируется на практических занятиях по курсу «Общая генетика» студентам биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета и в соответствующем Методическом пособии, снабженном компакт-диском с иллюстрациями ([17], с. 34 и слайды 5 и 6 к Лекции 11 на CD). Применения, описанные ранее, в основном касались использования концентрированных клеточных суспензий и регистрации редких событий (с частотами 10⁻⁶), таких как колонии вторичных ревертантов или рекомбинантов на специальных селективных средах. Пересмотренный более подробный протокол, оптимизированная конструкция пуассонера и некоторые новые их применения были опубликованы на английском языке в 1999 г. [18] и затем в 2002 г. в виде статьи под названием «Perfectorderplating: principleandapplications» (авторы: N. N. Khromov-Borisov, J. Saffi, J.A. P. Henriques) в международном рецензируемом онлайновом электронном журнале TTO – Technical Tips Online. Однако эту публикацию постигла печальная участь: два года спустя издательство Elsevier без предупреждения прекратило существование этого журнала, очевидно нарушив этим авторские права авторов.

Мы сочли целесообразным перевести эту статью на русский язык, дабы сделать описываемые в ней метод и приспособление доступными широкому кругу отечественных микробиологов. (На перевод несуществующей статьи из несуществующего журнала авторами получено разрешение издательства Elsevier).

Принцип упорядоченного посева и его применение

Принцип упорядоченного посева состоит в том, что небольшие равного объема капли суспензии микробных клеток помещают на поверхность агаровой среды в чашке Петри на равных расстояниях друг от друга. Такое расположение капель обеспечивает единообразные экологические и физиологические условия для роста клеток и, как результат, одинаковый размер колоний или идеальное распределение Пуассона для их числа.

Порождение колоний одинакового размера

Очень малые (объемом не более 1 мкл и диаметром не более 1 мм) капли густой суспензии клеток (~10⁶‑10⁸ кл./мл) помещают на агаровую поверхность по узлам правильной тригональной решетки (наподобие рисунка пчелиных сот с дополнительной точкой в середине каждой сотовой ячейки). Это можно осуществить либо вручную или с помощью специального инокулятора-пуассонера с заостренными на конце штырями. В первом варианте можно использовать любое устройство типа микропипетки или чертежного пера («рéдис») и подложенный под чашку Петри трафарет с диаграммой правильной тригональной решетки. После инкубации небольшие пятна, содержащие тысячи клеток, вырастают в колонии практически одинакового размера и формы (рис.1). При посеве следует избегать повреждений поверхности агара, в противном случае форма колоний будет нарушена.

Рис.1. Принцип упорядоченного посева: применение к исследованию роста колоний.
Очень маленькие капли (объемом менее 1 мкл и диаметром не более 1 мм) густой суспензии клеток дрожжей (~10⁶‑10⁸ кл./мл) помещены на поверхность агаровой среды с помощью чертежного пера («рéдис») по узлам правильной тригональной решетки (в соответствии с трафаретом, подложенным под чашку).
После роста в стандартных условиях инкубации получаются колонии, одинаковые по размеру и по форме.
Варьирование диаметра колоний на чашке исключительно мало: относительная стандартная ошибка составляет около 1%.

Пуассонер

Пуассонер представляет собой микробиологический инокулятор, конструкция которого обеспечивает распределение Пуассона для числа колоний на чашках Петри. Он изготовлен из нержавеющего металла и похож на штамп (или щетку) с цилиндрическими штырями (зубцами). Штыри могут быть сделаны из заклепок (диаметром ~2,0 мм и длиной 1,5‑2,0 см) с тщательно выровненными торцами. Они крепятся на металлической основе на равных расстояниях друг от друга таким образом, чтобы целиком заполнить внутреннюю часть чашки Петри. Рекомендуемое оптимальное количество штырей 163 или 187 с расстоянием между ними 3,0 мм (рис. 2).

Рис. 2. Пуассонер: общий вид (a) и одно из его рабочих положений – лицом вниз (b).

Пуассонер можно стерилизовать в пламени спиртовки, предварительно смочив спиртом его рабочую часть (торцы штырей). При этом следует избегать перегрева его металлических частей. Из соображений безопасности его ручка изготовляется из огнестойкого материала с низкой теплопроводностью (обычно из термостойкой пластмассы).

Пуассонер можно использовать в двух рабочих положениях: «лицом вниз» (рис. 2б) и «лицом вверх» как в классическом методе отпечатков (не показано). Первое положение используют для быстрой работы, когда надо засеять много чашек Петри без особо высокой точности. Перевернутое положение предпочтительно для достижения высокой точности. Соответственно, торец ручки делается плоским, чтобы перевернутый пуассонер твердо стоял на столе.

Порождение пуассоновского распределения для числа колоний с помощью пуассонера

В стерильную чашку Петри заливают 20‑25 мл суспензии микробных клеток и окунают в нее рабочую часть (штыри) стерильного пуассонера. Суспензию тщательно перемешивают, вращая пуассонер, и затем переносят его в чашку Петри с агаровой питательной средой. Перед этим следует проследить, у всех ли штырей на торцах образовались полусферические капли суспензии. Если не все штыри несут такие капли, то стоит очистить пуассонер от гидрофобных загрязнений с помощь спирта или моющего средства. Предпочтительными рабочими положениями являются: положение «лицом вверх» для пуассонера и положение «лицом (агаровой поверхностью) вниз» – для чашки Петри. Чашку Петри аккуратно помещают на рабочую часть пуассонера и нежно придавливают пальцами так, чтобы на агаровой поверхности образовались небольшие круглые вмятины (следы) от торцов штырей, но при этом поверхность агара не повредилась бы. Такие следы хорошо видны невооруженным глазом, но, к сожалению, плохо различимы на фотографиях (рис. 3 и 4). Через прозрачное дно чашки следят за тем, чтобы каждый штырь оставил след с каплей. Аккуратно удаляют чашку таким образом, чтобы предотвратить слияние капель.

Рис. 3. Расположение колоний, порожденное пуассонером (красные чашки) и традиционным методом посева с помощью пипетки и шпателя (зеленые чашки).
Представлены две пары чашек с примерно равным числом колоний: ~440 колоний в первом столбце и ~300 – во втором.

Рис. 4. Воспроизводимость результатов, порождаемых пуассонером.
С помощью пуассонера одна и та же клеточная суспензия была высеяна независимо двумя исполнителями (по три чашки Петри на каждого – зеленые и красные).
Вариабельность числа колоний очень мала: 360-390 колоний на чашку.

Анализ данных

После инкубации подсчитывают число следов (вмятин) от штырей пуассонера без колоний, с одной колонией, с двумя, тремя и т.д., и представляют данные в виде таблицы выборочного распределения (табл. 1). Такую процедуру повторяют с другими чашками Петри. Для полученных выборочных распределений проводят статистическую проверку согласия с распределением Пуассона.

Таблица 1. Распределения числа колоний дрожжей на 10-и чашках Петри, порожденные пуассонером,
и их сравнение с распределением числа колоний, полученных традиционным методом посева

[a] P-значения для точного дисперсионного критерия согласия с распределением Пуассона [30]. Для всех 10-и чашек (а также и для общего числа колоний, P = 0,97) отклонения от распределения Пуассона статистически незначимы. Распределения Пуассона, порожденные пуассонером, на всех 10-и чашках статистически однородны и воспроизводимы: P=0,69 получено как оценка Р‑значения для точного критерия Фишера (на основе 5×10⁶ рандомизаций) для таблицы сопряженности 10×10 с помощью программы StatXact‑4.
[b] Общее число колоний на чашках Петри, порожденное пуассонером, также статистически однородно, т.е. согласуется с распределением Пуассона: Pp = 0,66 согласно критерию Володина-Большева [31-33].
[c] Эти данные были получены с использованием той же суспензии клеток, но высеянными традиционным методом. Их гетерогенность статистически исключительно значима вследствие экстрапуассоновской вариабельности: Pt = 8.3×10⁻³³ согласно критерию Володина-Большева [31-33].

Для проверки согласия наблюдаемого варьирования числа колоний на каждом следе и (или) на каждой чашке Петри с ожидаемым распределением Пуассона было использовано несколько статистических процедур [26-33]. В частности были использованы точная и монте-карловская версии дисперсионного критерия Фишера (индекса дисперсии). Для этого была использована программа, созданная и любезно предоставленная Папвортом [30]. Согласие наблюдаемого варьирования общего числа колоний на чашках Петри, порожденных пуассонером и традиционным методом посева, с распределением Пуассона проверяли с помощью наиболее адекватного для этой цели изящного критерия Володина-Большева [31-33].

Преимущества метода упорядоченного посева

При использовании метода упорядоченного посева для измерения роста колоний вариабельность диаметра колоний исключительно низка: относительная ошибка измерений составляет около 1% (рис. 1). Такая точность сравнима с точностью хороших экспериментов в физике или в технике.

Метод упорядоченного посева позволяет достичь высокой точности при подсчете числа колоний. По сравнению с традиционными процедурами посева с помощью пипетки и шпателя, при использовании пуассонера образуются колонии, которые гораздо лучше отделены друг от друга и их расположение гораздо более равномерное (рис. 3 и 4). Метод позволяет на одной чашке Петри получать несколько сотен (500 и даже более) неперекрывающихся колоний. В результате достигается большая экономия расходных материалов: достаточно засеять 2‑3 чашки, чтобы оценить средние значения с относительной ошибкой около 5%.

Упорядоченный посев порождает «идеальное» пуассоновское распределение с высокой воспроизводимостью: подсчеты колоний на нескольких чашках Петри получаются статистически однородными (табл. 1, рис. 4 и 5) по сравнению с гетерогенными (с повышенной дисперсией) подсчетами колоний, получаемых из одной и той же суспензии клеток путем традиционного метода посева (табл. 1) и по сравнению с данными, опубликованными в литературе (рис.5) [4-8].

Рис. 5. Визуализация согласия с распределением Пуассона для опубликованных в литературе данных [4] (A) и данных, порожденных пуассонером (C) и их воспроизводимость (B).

Обозначения: Ось абсцисс на рис. А: варианты чашек Петри с наблюдаемым количеством колоний на них – i; ось ординат – количество таких вариантов чашек – N_i.
Оси абсцисс на рис. B и C: варианты следов (вмятин) от штырей пуассонера на агаровой среде в чашке Петри по количеству колоний на них – i;
ось ординат на рис. B – количество таких вариантов следов – n_i на каждой их 10-и чашек;
ось ординат на рис. C - суммарное число таких вариантов следов на всех 10-и чашках – N_i.
Квадратами и соединяющими их сплошными линиями на рис. A и B обозначены наблюдаемые распределения, а треугольниками и пуктирными линиями – теоретически ожидаемое распределение Пуассона.
Различными символами на рис. C обозначены данные по каждой из 10-и чашек Петри.

Использование пуассонера делает возможным проверять статистически, насколько хорошо наблюдаемое распределение числа колоний согласуются с теоретическим распределением Пуассона, потому что каждый след от штыря (вмятину) можно рассматривать как микро-чашку Петри (табл. 1). В данной лаборатории с помощью этой техники было посеяно несколько сотен чашек Петри, и ни разу не было обнаружено статистически значимое отклонение от распределения Пуассона. Более того, в тех случаях, когда число колоний на чашке получается настолько большим, что некоторые из них сливаются и их трудно различить, тогда можно использовать быстрый метод оценки средних значений [14,20].

Упорядоченный посев более быстр, прост и экономичен, чем традиционная техника посева. Он является хорошей альтернативой обычным методам посева. С помощью пуассонера можно засеять одну чашку Петри за секунду, в то время как посев одной чашки традиционным методом может занимать десятки секунд (иногда даже 1-2 мин). Дополнительная экономия вытекает из того, что стерилизация пуассонера очень дешева по сравнению с использованием как одноразовых чашек, шпателей и наконечников для дозаторов, так и расходных материалов многоразового использования, требующих длительных процедур стерилизации и больших затрат энергии.

Таким образом, упорядоченный посев можно использовать во многих микробиологических лабораториях. Он особо важен в таких областях экспериментальной и прикладной микробиологии, в которых требуются GLP и GSP, таких как генетика и селекция микроорганизмов, генетическая токсикология, биотехнология, эпидемиологическая, клиническая, фармацевтическая, сельскохозяйственная и промышленная микробиология, микробиологическая токсикология и микробиологический контроль качества и безопасности пищевых продуктов и лекарств. Он лучше может обеспечить безопасность при работе с патогенными микробами.

Недостатки метода упорядоченного посева

Подобно иным лабораторным приемам метод упорядоченного посева требует от экспериментатора некоторого навыка обучения. Очевидны также некоторые психологические моменты. Например, для экспериментатора, который привык к традиционной технике посева с помощью пипетки и шпателя, поначалу может показаться непривычным и неудобным необходимость работать со сравнительно большими объемами клеточных суспензий (20‑25 мл), помещенными не в пробирку, а в чашку Петри. Тем не менее, почти все приемы миниатюризации в микробиологии можно легко адаптировать к использованию пуассонера.

Материалы и оборудование

В данной работе были использованы дрожжи Saccharomyces cerevisiae, гаплоидный штамм N123, используемый как штамм дикого типа, в лаборатории GENOTOX при Центре биотехнологии Университета Рио Гранди ду Сул (Порту Алегри, Бразилия). Его генотип: MATa his1. Для его выращивания использовали стандартную полную среду YEPD для дрожжей [25].

Для графической визуализации была использована программа C.A.MAN [29]. Для достижения более высокого качества все графики были перерисованы с помощью программы Prizm-3. Для проверки однородности внутри каждого набора данных, представляющих собой таблицы сопряженности, были использованы точные и монте-карловские критерии, реализованные в пакете программ StatXact-4. Для фиксации изображений чашек Петри использовали сканер Hewlett-Packard ScanJet4 и соответствующее программное обеспечение.

Настоящая статья прошла экспертное рецензирование.

Благодарности

Авторы благодарят D. Papworth, A. Masuda, I. daSilvaVazJr., Д. Свешникова, А. Бородича, И. Рождественского и К. Квитко за помощь в работе. Работа была поддержана Бразильскими исследовательскими фондами: CNPq, CAPES, FAPERGSи GENOTOX – LaboratóriodeGenotoxicidade (UFRGS), а также шведским WallenbergFoundation.

Литература

1. Khromov-Borisov N.N. and Henriques J.A.P. Good Statistics Practice (GSP) in genetic toxicology // Mutat. Res., 1998. 405:97-108.
2. Student. On the error of counting with haemocytometer // Biometrika, 1907. 5:351-360.
3. Fisher R.A. et al. The accuracy of the plating method of estimating the density of bacterial populations. With particular references to the use of Thornton's agar medium with soil samples // Ann. Appl. Biol., 1922. 9:325-359.
4. Linhardt M.S. et al. In vitro information system for collection and analysis of experimental data // J. Environ. Pathol. Toxicol., 1980. 4:1-21.
5. Margolin B.H. et al. Statistical analysis of the Ames Salmonella/microsome test // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1981. 78:3779-3783.
6. Bogen K.T. Applicability of alternative models of revertant variance to Ames-test data for 121 mutagenic carcinogens // Mutat. Res., 1994. 322:265-273.
7. Voss B. et al. A multinomial model for the quality control of colony counting procedures // Biometr. J., 2000. 42:263-278.
8. Kim B.S. and Margolin B.H. Statistical methods for the Ames Salmonella assay: a review // Mutat. Res., 1999. 436:113-122.
9. Eaton, A.D. et al., (eds.) Standard Methods for Examination of Water and Wastewater (19th edn.). - Washington, DC, USA: American Public Health Association, 1995.
10. Хромов-Борисов Н.Н. Упорядоченный посев как метод изучения роста и мутирования микробов / Механизмы биологических процессов (Тр. III конф. молодых специалистов, 26–29 декабря 1972, Ленинград). - Л.: Изд-во ЛГУ, 1973. – с. 41.
11. Хромов-Борисов Н.Н. Метод упорядоченного посева для изучения роста и мутаций у микроорганизмов / Тезисы конф. по генетике промышленных микроорганизмов (10–14 декабря 1973). - Цахкадзор: АН СССР, 1973. – с. 44.
12. Хромов-Борисов Н.Н. и др. Использование метода упорядоченного посева для изучения внутригенной митотической рекомбинации у дрожжей-сахаромицетов / Тезисы Всес. конф. по генетическим основам селекции промышленных микроорганизмов (20–25 декабря 1975, Минск). – Минск: АН СССР, 1975. - с. 105–106.
13. von Borstel R.C. Measuring spontaneous mutation rates in yeast // Methods Cell Biol., 1978. 20:1-20.
14. Khromov-Borisov N.N. Biometrical aspects of measuring mutation rates // Methods Cell Biol., 1978. 20:20-24.
15. Хромов-Борисов Н.Н. Изучение мутагенного действия метоксиамина и 6‑гидроксиламионопурина на дрожжи Saccharomyce cerevisiae. Автореф. канд. дисс. Л.: Ленингр. гос. ун-т, 1976.
16. Инге-Вечтомов С.Г. Генетика с основами селекции. - М: Высш. шк., 1989. - с. 299–302.
17. Общая генетика. Методическое пособие / Под ред. С. Г. Инге-Вечтомова. – СПб: Изд-во Н-Л, 2007. – 124 с. + CD.
18. Khromov-Borisov N.N., Saffi J., Henriques J.A.P. POP (perfect order plating) and “poissoner” – new precise technique and device for microbiological toxicology studies / Anais da II Reunião Nacional de Microbiologia Aplicada ao Meio Ambiente (Proceedings of the Second National Meeting of Microbiology Applied to the Environment). Florianopolis (Brazil), 1999.
19. Gordenin D.A. et al. Yeast mutants with increased bacterial transposon Tn5 excision // Yeast, 1991. 7:37-50.
20. Morrison A. et al. Pathway correcting DNA replication errors in Saccharomyces cerevisiae // EMBO J., 1993. 12:1467-1473.
21. Shcherbakova P.V. et al. Base analog 6-N-hydroxylaminopurine mutagenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae is controlled by replicative DNA polymerases // Mutat. Res., 1996. 369:33-44.
22. Fedorova I.V. et al. The yeast HSM3 gene acts in one of the mismatch repair pathways // Genetics, 1998. 148:963-973.
23. Fedorova I.V. et al. The yeast HSM3 gene is involved in DNA mismatch repair in slowly dividing cells // Genetics, 2000. 154: 495-496.
24. Kozmin S.G. et al. Hypersensitivity of Escherichia coli Delta(uvrB-bio) mutants to 6-hydroxylaminopurine and other base analogs is due to a defect in molybdenum cofactor biosynthesis // J. Bacteriol., 2000. 182:3361-3367.
25. Evans, I.H. (ed.) Yeast Protocols: Methods in Cell and Molecular Biology. - Totowa, NJ, USA: Humana Press, 1996.
26. Merkle W. Poisson goodness-of-fit tests for radiation-induced chromosome aberrations // Int. J. Radiat. Biol., 1981. 40:585-692.
27. Gütler N. and Henze N. Recent and classical goodness-of-fit tests for the Poisson distribution // J. Statist. Plann. Inference, 2000. 90:207-225.
28. Karlis D. and Xekalaki E. A simulation comparison of several procedures for testing the Poisson assumption // The Statistician, 2000. 49:355-382.
29. Böhning D. Computer-assisted Analysis of Mixtures and Applications: Meta-analysis, Disease Mapping and Other. - Boca Raton, FL, USA: Chapman & Hall/CRC, 1999.
30. Papworth D.G. Exact tests of fit for a Poisson distribution // Computing, 1983. 31:33-45.
31. Володин И.Н. О различении распределений Пойя и Пуассона, когда доступно большое число малых выборок // Теор. вер. прим., 1965. 10:335-338.
32. Большев Л.Н. О характеризации распределения Пуассона и ее статистических приложениях // Теор. вер. прим., 1964. 10:446-456. Воспроизведено в кн.: Большев Л.Н. Избранные труды. Теория вероятностей и математическая статистика.– М.: Наука, 1987. – 286 с., с. 153-165.
33. Володин И.Н., Иоффе В.М. Вероятностные модели травматизма и распределение числа несчастных случаев на промышленных предприятиях. В кн.: Вопросы техники безопасности. – М.: ВЦНИИОТ ВЦСПС, 1973. – С. 5-23.

Портал «Вечная молодость» www.vechnayamolodost.ru
06.04.2009