CRISPR/Cas9 ищет мутантов

Российские учёные разработали новый метод быстрого отбора клеток с генными модификациями с помощью CRISPR/Cas9

Полина Кирсанова, пресс-служба ИТЭБ РАН

Настоящую революцию в генной инженерии произвело открытие системы CRISPR/Cas9. CRISPR – это короткие повторяющиеся участки в ДНК (дословно «сгруппированные короткие палиндромные повторы»), которые вместе с белками Cas (дословно «белки, связанные с CRISPR») представляют собой своеобразный аналог иммунитета у бактерий, они помогают микроорганизмам защищаться от вирусов. CRISPR хранят в себе информацию о вирусах, ранее атаковавших бактерии, а Cas разрезают вирусную ДНК для дальнейшего уничтожения. С 2013 года мировое научное сообщество начало применять эту систему для редактирования генов не только бактерий, но и высших организмов (активно проводятся первые эксперименты на клетках человека), что открывает новые возможности для лечения всевозможных болезней человека, включая тяжелейшие вирусные, онкологические и наследственные (например, ВИЧ, синдром Дауна и др.).

Российские ученые из 6 крупных научных организаций Москвы и Пущино совместно разработали новую стратегию получения клеточных нокаутов, которая избавляет от долгой и кропотливой процедуры выращивания и скрининга клонов в целях поиска желаемой мутации. С результатами этого крупного исследования подробнее можно ознакомиться в февральском номере журнала Scientific Reports (Zotova et al., Isolation of gene-edited cells via knock-in of short glycophosphatidylinositol-anchored epitope tags).

Основной разработчик данного подхода, Мазуров Дмитрий Вячеславович, кандидат медицинских наук, руководитель группы клеточных и генных технологий Института биологии гена РАН поделился с пресс-службой ИТЭБ РАН основной идеей метода «Разработанный нами новый метод отбора редактированных клеток заключается в том, что клетки с искомой генной модификацией экспонируют на своей поверхности короткий пептид. С помощью антитела к данному пептиду и, используя метод клеточной сортировки, можно легко и быстро выделить желаемые клетки-нокауты по любым генам, в том числе продукты которых находятся внутри клетки или секретируются во внешнюю среду. Генетическая конструкция, которую мы разработали, и которая позволяет пептиду транспортироваться на поверхность клетки и одновременно выключать ген, является самой короткой, но в тоже время эффективной среди существующих в настоящее время маркеров селекции. Мы назвали наш метод SORTS (surface oligopeptide knock-in for rapid target selection), аббревиатура которого в переводе близка к слову «сортировка» и отражает суть нового метода. SORTS оказался полезным не только для необратимой инактивации гена, но и для регулируемого с помощью так называемого дегрона выключения гена на уровне белка, что позволяет изучать функцию жизненно важных генов».

Соавтор данной работы, Холмухамедов Эхсон Лукманович, доктор биологических наук, главный научный сотрудник лаборатории фармакологической регуляции клеточной резистентности Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, подтвердил новизну и экспериментальные преимущества нового подхода: «Разработанный метод обеспечивает быстрый и эффективный отбор полученных нокаутов без длительного и трудоемкого метода клонирования клеток, что позволило нам быстро и надежно получить три линии генетически отредактированных клеток эмбриональных почек человека, нокаутных по содержанию митохондриальных поринов». Применение этого метода, по утверждению авторов «подходит для любых генов, а также может иметь дополнительные преимущества по сравнению с уже имеющимися методами молекулярной биологии». На примере клеточных культур человека, зараженных ВИЧ, авторский коллектив уже продемонстрировал возможность уничтожения данного вируса, ДНК которого стабильно встраивается в геном человека и не может быть удалена современными средствами лечения. Работа в этом направлении продолжается.

Исследование поддержано грантами 18-14-00333, 17-14-01107 Российского научного фонда, программой фундаментальных научных исследований государственных академий на 2013-2020 годы, грантами 18-29-07052, 18-04-01016 и 18-34-00712 от Российского фонда фундаментальных исследований, а также проектом 14.Z50. 31.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru