Секвенирование генома: вам ДНК целиком или нарезать?

Сделан важный шаг на пути к всеобщей генетической переписи
Алексей Тимошенко, GZT.RU

Ученые сделали важный шаг на пути к лечению наследственных заболеваний и генной терапии. Исследования индивидуальных различий ДНК проведены с ранее недоступной точностью.

Генетики, результат работы которых представлен в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences (Brian Teague et al., High-resolution human genome structure by single-molecule analysis), продемонстрировали новый метод анализа генома человека. При помощи метода так называемого оптического картирования ДНК им удалось выявить значительные участки, отличающиеся у разных людей, причем сделать это достаточно быстро и дешево.

Выявление индивидуальных различий в масштабах всей ДНК, как пишут авторы исследования, подобно возможности просматривать снимки в Google Earth. Вместо того, чтобы выхватывать отдельные детали, полное сканирование позволяет увидеть всю картину.

Как это работает?

Как именно исследователям удалось добиться более быстрого и дешевого сканирования? Для ответа на этот вопрос надо сначала сказать, что традиционный способ прочтения ДНК основан на двух процессах:

• разрезание молекулы ДНК на множество кусков длиной около тысячи нуклеотидных пар каждый
• размножение каждого фрагмента при помощи так называемой полимеразной цепной реакции

Сопоставляя между собой множество фрагментов и определяя последовательность нуклеотидных пар в каждом из них, ученые собирают весь геном – но чем меньше отдельные куски, тем более сложную задачу приходится решать. Если считать, что весь набор анализируемых молекул ДНК подобен книге, то традиционный способ секвенирования (прочтения) ее будет подобен реконструкции текста по обрывкам одинаковой формы с отдельными предложениями или даже словами.

И в этом, по словам Брайна Тигью (Brian Teague), одного из авторов исследования и ученого из университета Висконсина, кроется основной недостаток обычной технологии. Продолжая книжную аналогию, можно сказать, что генетики получают помимо уникальных кусков текста (например»...ien, mon prince. Genes et Lucques ne sont plus que des apana…» – однозначно фрагмент первого абзаца «Войны и мира») участки, которые нельзя однозначно расположить в общей мозаике (куда, например, попадет фрагмент «За столом»? Только в первом томе произведения Толстого подходящих мест пять!). Если бы куски были больше, вроде»...еи, служившие за столом, казалось, чувство...» – таких проблем не возникло. А еще лучше, конечно, читать книгу, а не кучу нарезанных из нее листков.

 
Принципиальная схема оптического картирования ДНК:
при помощи флуоресцентных зондов можно определить,
в какой последовательности следует собирать ДНК из кусков.
Источник: Fong Chun Chan, Kendric Wang

Первый шаг на пути к быстрому чтению ДНК группа Дэвида Шварца (David Schwartz) в Висконсинском университете, сделала еще в 1993 году. Тогда учеными была создана технология, позволившая сначала разрезать ДНК на сравнительно крупные (миллион пар нуклеотидов против тысячи!) участки, пометить каждый из них флуоресцентным красителем и потом проанализировать их последовательность. Получилось быстрее, но для серьезной работы с геномом человека при более-менее адекватных затратах времени и средств этого все равно не хватало.

Спустя десять лет, в 2003 году, от «разрывания книги на кусочки» удалось отказаться – был создан метод, позволяющий обойтись одной молекулой ДНК, которую лишь надрезали, растаскивали ее нити в стороны и после этого определяли последовательность нуклеотидов при помощи флуоресцентных меток.

 
Схема метода, позволяющего при анализе генома
обойтись без нарезания молекулы ДНК на много мелких кусочков.
Источник: Fong Chun Chan и Kendric Wang

В 2004 году метод был апробирован при прочтении ДНК бактерий, в 2007 году его использовали для изучения генома риса, в 2009 проанализировали маис – а потом настала и очередь человека.

Что в итоге?

По словам Шварца, их новая разработка равносильна переходу от телескопов к наблюдению неба в бинокль или невооруженным глазом. Это может показаться парадоксальным сравнением, но ученый поясняет, что далеко не всегда пристальный взгляд на одну деталь позволяет получить всю необходимую информацию. И подобно тому, как астрономы наряду с мощными инструмента вроде орбитального телескопа «Хаббл» используют широкоугольные камеры (например систему поиска астероидов WISE), генетики заинтересованы не только в поисках локальных отличий на уровне отдельных нуклеотидов. Знание о том, как отличаются молекулы ДНК на уровне крупных повторяющихся участков, может быть не менее важным.

Кроме того, Шварц утверждает, что в скором времени (на протяжении нескольких лет) прочитать персональный геном можно будет за час, а стоимость секвенирования снизится до $1000 на человека – а это переведет пока что доступную только избранным научным институтам процедуру в разряд рутинных (хотя и дорогих, примерно столько же стоит сложное томографическое обследование) медицинских операций.

Так на рубеже веков стремительно дешевело прочтение генома.
Источник: Human Genome Project Information

Вышеописанная методика может быть использована для изучения ранее недоступных особенностей персональных генетических различий, составляющих фрагменты в тысячи, сотни тысяч и миллионы нуклеотидов (единичных «букв» ДНК), которые могут меняться друг с другом местами, повторяться, менять длину или располагаться в хромосомах в обратном порядке. Роль таких вариаций ДНК до конца не выяснена. Тем не менее, согласно некоторым исследованиям, они могут оказывать значительное влияние на работу генов, отвечающих за синтез белковых молекул.

До сих пор, изучая различия в индивидуальных геномах, ученые концентрировали свое внимание на так называемых единичных нуклеотидных полиморфизмах – заменах отдельных «букв» ДНК в геноме, состоящем примерно из 3 миллиардов нуклеотидов. Такой подход был обусловлен тем, что существующие методики секвенирования ДНК, основанные на «нарезании» хромосом на короткие фрагменты, не позволяют изучить изменчивость, затрагивающую повторы, удаления и перемещения крупных фрагментов ДНК. Кроме того, часть генетической информации при этом остается непрочтенной.

При анализе четырёх персональных геномов Шварц и коллеги нашли более 4 тысяч различий в крупных участках хромосом. По мнению ученых, изменчивость на этом уровне может объяснить не только уникальность каждого из миллиардов людей, обитающих на Земле, но и выявить генетические причины тех или иных болезней или отклонений в развитии, и разработать методы их лечения.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru
02.06.2010