Подписаться на новости
  • Сенатор
  • ООО "Ай Вао"
  • Vitacoin

Чиним любые снипы

Генетики научились чинить все точечные мутации в ДНК без «ножниц»

Анна Казнадзей, N+1

Генетики создали инструмент для редактирования генома, который не нуждается в разрезании обеих цепей молекулы ДНК и может «откатывать назад» мутации, превращая пары нуклеотидов A-T в G-C пары. До этого подобные редакторы были способны менять только G-C на A-T пары, то есть охватывали лишь половину вариантов мутаций. Работа Gaudelli et al. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage опубликована в журнале Nature.

Примерно половина болезнетворных мутаций в ДНК человека связана со спонтанным отделением аминогруппы (дезаминирование) от нуклеотида цитозина (С), что ведет к замене пар C-G на пары T-A. Дезаминирование аденина, в свою очередь, ведет к появлению инозина, который воспринимается полимеразами как гуанин, и эта реакция могла бы быть способом «откатить» превращение C-G в T-A. Однако до сих пор ферментов, способных успешно дезаминировать аденины в ДНК, не существовало. Ученым удалось разработать редакторы адениновых оснований (adenine base editors, ABEs), создав их на основе адениновых деаминаз тРНК, «пришитых» к модифицированной системе CRISPR-Cas9. Система в данном случае необходима, чтобы находить правильную последовательность ДНК.

Наиболее распространенные редакторы оснований способны, наоборот, превращать пары C-G в пары T-A. Они состоят из нескольких компонентов: модифицированной системы CRISPR-Cas9, которая не способна вносить двухцепочечные разрезы в ДНК, но способна находить нужный ее участок; цитидиловой деаминазы, способной заменять цитозин на урацил в пятинуклеотидном окне одноцепочечного «пузыря», который создает на ДНК белок Cas9; и ингибитора урациловой гликозилазы, который препятствует вырезанию урацила и ряду других процессов, влияющих на чистоту продукта редактирования. Никазная активность системы позволяет ей также совершать одноцепочечный разрез на «противоположной», нередактируемой цепи ДНК, чтобы активировать работу системы репарации ДНК, которая заменит там гуанин на аденин. Такие редакторы успешно работают в геномах мышей, растений, дрожжей, рыб и даже человеческих эмбрионов. Они не требуют для работы ДНК-шаблонов. Подробнее почитать о них можно здесь.

Для того, чтобы создать подобный же редактор, но превращающий пары A-T в G-C, ученые из Гарварда и MIT выбрали ряд известных адениновых деаминаз кишечной палочки, человека и мыши, которые успешно дезаминировали свободные аденины, аденозины, аденозины в составе РНК и аденозины в спаренных РНК-ДНК гетеродуплексах. Их вносили в клетки бактерий с помощью плазмид и изучали их активность. Оказалось, что в своем исходном виде ни один из ферментов не мог эффективно дезаминировать аденозины в двухцепочечной ДНК.

Ученые воспользовались методами белковой инженерии и направленной эволюции, имитирующей естественный отбор в строго заданных условиях. Они работали с бактериями, имеющими мутации в гене резистентности к антибиотикам. Их обрабатывали антибиотиками, и резистентность к ним возникала у бактерий, у которых геномное редактирование (чинящее гены резистентности) происходило успешно. Наилучшие результаты показала деаминаза тРНК TadA. Для повышения эффективности работы фермента был проведен ряд его модификаций, в частности, этап селекции показал, что для успешной работы с ДНК ему необходима мутация в позиции D108 в соответствующем гене, и такая мутация была в него внесена. Кроме того, выяснилось, в том числе, что эффективность работы фермента повышается в случае его димеризации.

TadA.jpg

Схема направленной эволюции для получения эффективных геномных редакторов и внедрение их в клетки млекопитающего. Рисунки из статьи в Nature.

В результате в седьмом поколении ученые получили эффективные редакторы (ABE7.10), заменяющие нужные A-T пары на G-C пары с эффективностью до 50 процентов. При этом уровень побочных вставок и делеций составлял, в среднем не более 0,1 процента. Более распространенные методы геномного редактирования на основе CRISPR-Cas9 систем связаны с внесением двойных разрывов в цепи ДНК, и этот процесс, как правило, порождает гораздо больше побочных вставок и делеций. Кроме того, редактирование с помощью ABEs оказалось более точным, поскольку его работа производила меньшее число нецелевых замен.

TadA1.png
Схема работы ABE-редактора

Ученые отдельно провели эксперимент, демонстрирующий эффективность работы ABE при редактировании болезнетворных мутаций. Известно, что мутации в гене бета-глобина вызывают широкий спектр заболеваний крови. Некоторые их носители, однако, резистентны к ним благодаря мутациям в промоторных областях генов гамма-глобина. Ученые разработали специфический редактор ABE, который вносит мутации в эти области, заменяя А-Т на G-C. Он продемонстрировал 29- и 30-процентную эффективность на двух промоторах в клетках HEK293T.

Подобный же эксперимент был проведен с геном HFE, мутация в котором вызывает у людей гемохроматоз. Фермент успешно сработал в 28 процентах случаев, заменив 845-й нуклеотид в гене, и соответственно, изменив аминокислоту соответствующего белка с тирозина на цистеин.

Ученые отмечают, что превращение цитозина в тимин или урацил происходит от 100 до 500 раз в день в каждой клетке человека. Этот процесс может приводить к возникновению мутаций в важных участках ДНК и вести к возникновению самых разных генетических заболеваний. Получение геномных редакторов, способных восстанавливать исходную последовательность ДНК, как в случае с А-Т, так и в случае с G-C парами – важный шаг для методов генной инженерии.

А узнать о первых экспериментах с человеческими эмбрионами и редакторами, превращающими пары C-G в пары T-A, можно здесь.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru


Читать статьи по темам:

генотерапия снипы Версия для печати
Ошибка в тексте?
Выдели ее и нажми ctrl + enter
назад

Читать также:

Генная терапия для «детей в пузыре»

Национальная служба здравоохранения Великобритании будет оплачивать генотерапию наследственного иммунодефицита.

читать

Генотерапия для лошадей

Биологи из Москвы, Казани и Великобритании создали экспериментальную генную терапию и вылечили при ее помощи лошадь от хромоты.

читать

Вторая генотерапия лимфомы

FDA одобрило метод генной терапии Yescarta для лечения определенных типов крупноклеточной В-клеточной лимфомы.

читать

Biotechclub–2017

Наследственные заболевания, генная терапия и редактирование человеческого генома были среди главных тем конференции «Biotechclub–2017».

читать

Подконтрольная эволюция

Термин «генетически модифицированный организм» подразумевает, что геном того или иного объекта был изменен. Как и для чего его меняют?

читать