Генетическая модификация эмбриональных стволовых клеток: эффективность повышается
Биологи университета Калифорнии в Сан-Диего, работающие под руководством профессора Яна Сюя (Yang Xu), разработали эффективный метод генетической модификации человеческих эмбриональных стволовых клеток с помощью искусственных бактериальных хромосом, осуществляющих доставку внутрь клеток дефектных вариантов генов. Получаемые с помощью этого метода линии клеток можно использовать как в качестве моделей для изучения генетических заболеваний человека, так и для скрининга потенциальных терапевтических агентов.
Результаты работы опубликованы в январском номере журнала Cell Stem Cell в статье «Modeling Disease in Human ESCs Using an Efficient BAC-Based Homologous Recombination System».
Эффективность большинства существующих методов изменения генотипов клеток чрезвычайно низка и обеспечивает появление генетических модификаций менее чем в 1% обработанных клеток. Для решения этой проблемы авторы использовали искусственные бактериальные хромосомы – синтетические кольцевые ДНК, реплицируемые бактериями наравне с собственным генетическим материалом. Коммерчески доступные искусственные бактериальные хромосомы можно модифицировать внутри бактериальных клеток, например, встраивая в них измененные копии изучаемых генов. При введении в человеческие клетки такие хромосомы могут присоединяться к ДНК человека и вступать в процесс гомологичной рекомбинации – обмена комплементарными участками.
Преимущество, предоставляемое использованием искусственных бактериальных хромосом, обусловлено наличием длинных последовательностей, продолжающих оба концевых участка изучаемого гена и повышающих вероятность взаимодействия хромосом с ДНК человека и обмена генов до 20%. Эффективность других генетических подходов ограничена более короткими сегментами ДНК.
В результате двукратного применения предлагаемого подхода авторы создали линию человеческих эмбриональных стволовых клеток, несущих по две дефектных копии гена-супрессора опухолевого роста р53.
Они также успешно встроили в геном клеток ген АТМ, мутация которого приводит к развитию у человека атаксии-телеангиэктазии – заболевания, характеризующегося комплексом системных дефектов, в том числе высоким риском развития рака, дегенерацией определенных типов клеток мозга и деградирующими теломерами (защитными концевыми участками хромосом, длина которых определяет количество делений клетки).
Для генетически модифицированных мышей, имеющих две поврежденные копии гена АТМ, характерны некоторые симптомы атаксии-телеангиэктазии, однако у них не происходит дегенерации нейронов и укорочения теломер. Авторы считают, что эмбриональные стволовые клетки полученной ими линии являются более адекватной моделью для изучения этого заболевания. Они уже установили, что такие клетки имеют деградировавшие хромосомы. Изучение других симптомов заболевания, таких как деградация определенных типов нейронов, является целью их дальнейшей работы.
Исследователи считают, что предлагаемый ими подход можно использовать для модификации других генов в других линиях человеческих эмбриональных стволовых клеток. Изначально они использовали для экспериментов линию, быстро формирующую новые колонии из индивидуальных клеток, однако им удалось повторить процедуру и на другой клеточной линии H9, трудно поддающейся манипуляциям.
Евгения Рябцева
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru по материалам University of California, San Diego: Biologists Develop Efficient Genetic Modification of Human Embryonic Stem Cells.
15.01.2010