Обойти защиту
По словам профессора Норберта Райха (Norbert Reich) из университета Калифорнии в Санта-Барбаре, человеческим клеткам не нравится, когда в их внутреннюю среду внедряются что-либо чужеродное. В процессе эволюции они выработали механизм «избавления от мусора», обеспечивающий изолирование и расщепление чужеродных белков и других ненужных биомолекул, патогенов и даже поврежденных клеточных структур. Поэтому результаты, получаемые специалистами, работающими в областях биотехнологии, биофармакологии, а также геномных исследований и клинической медицины, в том числе с технологией редактирования геномов CRISPR-Cas9, хороши настолько, насколько эффективно им удается обойти этот защитный механизм и внедрить белки внутрь животных клеток.
Исследователям, работающим под руководством профессора Райха, удалось разработать метод, решающий эту проблему. Предложенная ими технология, эффективность которой по оценкам исследователей в 100-1000 раз выше, чему существующих методов, предоставляет пользователю полный пространственно-временной контроль над доставкой разрезающих ДНК белков. Другими словами, она позволяет контролировать момент и место высвобождения этих белков с точностью вплоть до отдельных клеток и их компонентов.
Одним из недавних прорывов в области биотехнологии является использование редактирующих геном белков – «молекулярных ножниц», таких как CRISPR, Cas и, в данном исследовании, Cre – для поиска, разрезания и вставки специфичных фрагментов последовательностей ДНК. Взяв за основу защитный механизм, используемый бактериями для распознавания ДНК атакующих их вирусов и мечения их для разрушения, специалисты разработали метод распознавания, разрезания и связывания последовательностей пар нуклеотидных оснований разной длины с помощью различных белков. Потенциал данной технологии огромен и варьирует от фундаментальных исследований по изучению функций и идентификации генов до методов генотерапии, позволяющих устранять вызывающие заболевание генетические дефекты на клеточном уровне.
Ключевыми компонентами предложенной авторами системы для редактирования генов являются свет ближнего инфракрасного диапазона и полые золотые наносферы, покрытые репортерными цепочками ДНК (флуоресцирующую красным светом) и химерным белком, состоящим из Cre-рекомбиназы и проникающих внутрь клетки пептидов. Наносферы выступают в роли носителя, а Cre-рекомбиназа и химерный белок – в роли системы самонаведения, вступающей в игру в тот момент, когда клетка-мишень запускает механизм избавления от мусора.
После проникновения внутрь клетки вся система оказывается внутри эндосомы – мембранного мешочка, изолирующего ее и транспортирующего по клетке. Однако в таком состоянии она совершенно неактивна. Для высвобождения наносфер на клетки воздействуют пульсирующим излучением ближнего инфракрасного диапазона, которое эффективно проникает вглубь тканей и безвредно для клеток.
Под действием света ближнего инфракрасного диапазона происходит очень интересный процесс: золотые наносферы возбуждаются и сбрасывают всё со своей поверхности. Одновременно с этим происходит формирование нанопузырьков, заставляющих эндосомы приоткрываться и выпускать наружу белковое содержимое. Высвобожденные белки находят дорогу к клеточному ядру и проникают внутрь, где начинает действовать Cre-рекомбиназа, разрезающая ДНК и вставляющая в разрезы свои репортерные последовательности.
Проведенные авторы эксперименты in vitro продемонстрировали эффективность метода. По окончании периода инкубации и воздействия ближнего инфракрасного диапазона излучения клетки, внутрь которых проникли покрытые белками наносферы, начинали светиться красным благодаря встроенному в геном флуоресцирующему белку.
Авторы поясняют, что в качестве фундаментального исследовательского инструмента редактирование генома с пространственно-временным контролем позволяет делать в каждой клетке отдельный эксперимент. Путем активации или инактивации гена-мишени он позволяет в реальном времени наблюдать изменения в поведении клетки и ее взаимодействии с окружением.
В клинической практике он обеспечит возможность избирательно модифицировать клетки, экспрессирующие ген, ответственный за развитие патологии, не затрагивая здоровые ткани. Помимо этого возможность контролировать момент активации механизма редактирования ДНК исключает долгосрочные последствия, ассоциированные с применением современных методов, часто оставляющих внутри клетки активную форму редактирующей ДНК системы.
Статья Demosthenes P. Morales et al. Light-Triggered Genome Editing: Cre Recombinase Mediated Gene Editing with Near-Infrared Light опубликована в журнале Small.
Евгения Рябцева, портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru по материалам University of California, Santa Barbara: Better Genome Editing