Подписаться на новости
  • Сенатор
  • ООО "Ай Вао"
  • medtech
  • ММИФ-2018
  • Vitacoin

С точностью до нуклеотида: подробности

Редактирование генома добралось до точечных мутаций

Александр Ершов, N+1

Биологи из Гарвардского Университета модифицировали метод редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas9 таким образом, что теперь точечные изменения в ДНК можно вводить без разрезания ее нитей, которое может быть опасно само по себе. Новая методика подразумевает исправление точечных мутаций гораздо более прямым путем, чем это делалось до сих пор. Работа опубликована в журнале Nature (Komor et al., Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage).

Ранее схема редактирования генома как в случае точечных мутаций, так и при внесении больших вставок или делеций, была одной и той же. Ученые вводили в клетку направляющую последовательность РНК, которая должна была найти ген-мишень, а также фермент-ножницы, способный разрезать ДНК в том месте, где укажет направляющая последовательность.

Появление разрыва стимулирует клетки как можно быстрее от него избавится. Если после разрыва у клеточных ферментов нет «под рукой» подходящего образца для восстановления цельной последовательности, то происходит простое скрепление разорванных концов нити ДНК (путь non-homologous end joining). Такой путь опасен тем, что ферменты могут случайно вводить лишние основания, сбивая аминокислотную рамку считывания гена.

Если задача исследователей заключается в том, чтобы просто «сломать» ген – такая неаккуратность ферментов работает в пользу ученых. Но если цель в том, чтобы точечно заменить один нуклеотид на другой (как в случае многих наследственных заболеваний), или ввести новую последовательность, то необходимо снабжать клетки правильной последовательностью-образцом. Такая последовательность, если она достаточно похожа на разорванную, заменяет ее собой – этот процесс называется гомологичной рекомбинацией. Снабжая клетки одновременно ферментом-ножницами с направляющей РНК и последовательностью-образцом с нужной мутацией, можно вводить в геном точечные или любые другие изменения.

Проблема в том, что реальная эффективность рекомбинации невелика (не более десятка процентов) и для точечных мутаций сильно избыточна и переусложнена. Поэтому авторы статьи изобрели новый подход к внесению точечных мутаций. Он, как и классический CRISPR/Cas9, на первом этапе включает поиск геномной мишени за счет направляющей РНК, но разрыва в нее не вносится. Вместо этого один нуклеотид прямо заменяется на другой с помощью прикрепленного к Cas9 специального фермента.

В своей работе авторы приводят такую схему. Один из нуклеотидов пары GC сначала лишается аминной группы – цитозин превращается в урацил (C→U). Образуется неправильная пара GU. Такие пары может находить система точечной репарации (это отдельная клеточная система, не связанная с репарацией разрывов), и вырезать один из нуклеотидов. Если из «неспаренной пары» вырезается G, а не U, то в конце концов мы получаем ген, где на месте исходной пары GC появился новый AU (или AT, в генетическом смысле это одно и то же).

precise-CRISPR.jpg
Схема замены пары нуклеотидов GC на AT из статьи в Nature

Из двух оснований «неспаренной пары» одно, предназначенное к удалению, выбирается ферментами случайно, если только речь не идет о свежесинтезированной ДНК. Однако ученые смогли сдвинуть случайность в нужную сторону, внеся одноцепочечные разрывы только в одну из двух цепей ДНК за счет остаточной активности Cas9. В результате ученые добились замены последовательности у 15-75 процентов клеток в культуре на нужную. При этом уровень ошибок (когда разрыв в ДНК все-таки происходил и он заканчивался простым склеиванием ДНК) составил менее одного процента случаев.

Основным недостатком нового метода является то, что для каждого типа изменения, которое нужно ввести в ДНК, требуется подобрать свой собственный набор ферментов. Новый метод пока позволяет менять только пары CG на AT. Для того, чтобы ввести обратную мутацию, требуется использовать другие ферменты и, возможно, другой подход. Тем не менее, это потенциально позволяет лечить многие генетические болезни, очень большая доля которых связана как раз с такими точечными мутациями. Подробнее о методе CRISPR/Cas9 можно прочитать здесь.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru
 21.04.2016

Читать статьи по темам:

генная инженерия снипы мутация Версия для печати
Ошибка в тексте?
Выдели ее и нажми ctrl + enter
назад

Читать также:

Химера против рака

Идея создания химерных антигенных рецепторов (сhimeric antigen receptor, CAR) принадлежит химику и иммунологу Зелигу Эшхару из Института наук имени Вейцмана.

читать

На те же грабли

Китайские биологи сделали новую попытку использовать систему CRISPR/Cas9 для редактирования генома человеческих эмбрионов – такую же безуспешную, как и в прошлый раз.

читать

CRISPR/Cas9: краткая энциклопедия

Константин Северинов – об иммунной системе бактерий, механизме действия CRISPR/Cas9 и результатах редактирования генома человеческих эмбрионов

читать

Программирование ДНК: как и зачем

Технология программного кода «Cello» позволяет прописывать в ДНК бактерий требуемый набор свойств и создавать биологические схемы с нужными логическими параметрами, работающие внутри живой клетки.

читать

Язык программирования для ДНК

Инженеры из Массачусетского технологического института разработали язык ДНК-программирования, который позволит человеку без углубленных знаний биологии создавать бактерии с желаемыми свойствами.

читать