Генетическая регуляция плюрипотентности стволовых клеток
Стволовые клетки не были бы интересны для биологии развития и клинической медицины, если бы они не обладали плюрипотентностью и были бы не способны запускать вновь развитие. Разработка условий культивирования линий клеток, происходящих из эмбрионов, поиск путей увековечивания плюрипотентности стволовых клеток является необходимой базой, которая обеспечит их использование в русле регенеративной медицины для восстановления нарушенных структур и функций органов и тканей и лечения широкого круга заболеваний. Глубокое понимание молекулярных программ, направленных на поддержание состояния плюрипотентности стволовых клеток и регулирующих их дифференцировку, необходимо для того, чтобы иметь возможность управления их потенциалом.
Исследования различных линий эмбриональных стволовых клеток позволили выявить и уточнить организацию генных сетей, контролирующих ранние этапы развития. На основе этих исследований возникло представление о существовании так называемых генов-господ и генов-рабов. Развитие эмбриона млекопитающих контролируется ключевыми регуляторными генами, влияющими на транскрипцию других генов. Эти регуляторы активируют или репрессируют экспрессию генов, которые опосредуют фенотипические изменения в ходе дифференцировки стволовых клеток. Они включают каскады структурных генов и тем самым определяют органно-тканевую специализацию. К числу таких важнейших генов-господ относятся различные семейства факторов транскрипции. Например, семейство POU может активировать экспрессию генов-мишеней путём связывания с определённой нуклеотидной последовательностью на ДНК – это октамер AGTCAAAT.
На молекулярном уровне плюрипотентность определяется факторами транскрипции, от экспрессии которых, по-видимому, зависит - будет ли клетка плюрипотентной или нет. Так, исследования последних лет выявили фактор транскрипции OCT4, принадлежащий к выше упомянутому семейству POU. Исследования на линиях эмбриональных стволовых клеток мышей показали, что OCT4 почти полностью экспрессируется только в эмбриональных клетках: на начальной стадии – во всех бластомерах, затем – ограниченно, только во внутренней клеточной массе. Прицельное разрушение OCT4 приводит к образованию эмбрионов без плюрипотентной клеточной массы, что указывает на его важнейшую роль в контроле плюрипотентности и дифференцировки. Гены-мишени, которые в действительности ответственны за выполнение решений OCT4, известны только частично.
Дальнейшие исследования обнаружили другие транскрипционные факторы, определяющие состояние плюрипотентности. К ним относится SOX2. Он принадлежит к семейству ДНК-связывающих белков, которые участвуют в регуляции транскрипции и структуры хроматина. При изучении мутантов по этому гену была выявлена автономная потребность в его экспрессии для клеток раннего этапа развития. Сходная роль была выявлена и для других генов, которые экспрессируются в популяции клеток-основательниц эмбрионов – FOXD3. Это ген принадлежит к другому семейству транскрипционных факторов.
Сотрудники института исследований стволовых клеток при эдинбургском университете и японского института Нара обнаружили ещё один ген, который рассматривается также как маркёр плюрипотентности. Этот ген получил название NANOG, по имени страны вечной юности Тир Нан Ог из кельтской мифологии. Функция NANOG в зародышевых клетках прогрессивно уменьшается по мере развития эмбриона. NANOG, по-видимому, является одним из нескольких факторов, которые экспрессируются в плюрипотентных клетках и подавляются в начале дифференцировки. Этот ген был открыт при изучении линий мышиных эмбриональных стволовых клеток и в настоящее время пока не входит в группу из 532 генов, которые были идентифицированы как специфичные для эмбриональных стволовых клеток человека.
Блокирование дифференцировки эмбриональных стволовых клеток как in vitro, так и in vivo обнаружено ещё для одного белка - Pem. Ген PEM регулирует переход между недифференцированными и дифференцированными клетками у ранних эмбрионов мышей.
Таким образом, к настоящему моменту идентифицированы ряд генов, экспрессия которых контролирует ранние этапы эмбрионального развития, когда многие эмбриональные стволовые клетки обладают свойством тотипотентности или плюрипотентности.
Кроме того, для реализации и поддержания состояния плюрипотентности необходимо наличие определённых сигналов и системы их передачи. К таким сигналам относится фактор LIF (leukaemia inhibitory factor), который необходим для поддержания недифференцированного состояния мышиных эмбриональных стволовых клеток. LIF осуществляет свой эффект путём связывания с соответствующим рецептором. Последующая передача сигнала в ядро происходит посредством STA3, функционирующего как транскрипционный фактор. Примечательно, что эта система не предотвращает дифференцировку человеческих эмбриональных стволовых клеток. К другим сигналам можно отнести BMP4 (bone morphogenetic protein-4), который в присутствии LIF усиливает самообновление и плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток через активацию гена SMAD, кодирующего также транскрипционный фактор, и последующей активации семейства генов Id (inhibitor of differentiation). Недавние исследования выявили важность участия белков WNT в системе передачи сигналов, а также гена PTEN, контролирующего фосфатазу и находящегося на этапе завершения передачи сигнала.
Указанные регуляторные элементы функционируют в определённой последовательности, между ними существуют установившиеся иерархические связи, что и определяет конечный эффект. В частности, в мышиных эмбриональных стволовых клетках активация цитокинами пути, опосредованного рецептором LIF, и поддержание экспрессии Oct4 и Nanog являются ключевыми элементами генетической программы, которая позволяет эмбриональным клеткам быть стволовыми – состояние 'stemness'. Другие пути и факторы являются наложенными друг на друга ключевыми элементами. Всё это увеличивает комбинаторную сложность регуляции.
Многие механизмы регуляции плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток ещё далеки до полной ясности. Кроме того, результаты, полученные для мышиных стволовых клеток, не всегда приложимы к стволовым клеткам человека. Однако такого рода исследования необходимы для разработки оптимальных характеристик линий стволовых клеток и условий их поддержания, а также для формулирования стандартов исследовательской работы со стволовыми клетками человека.