Подписаться на новости
  • Сенатор
  • ООО "Ай Вао"
  • techweek
  • Biohacking
  • Био/​мол/​текст

Эмбриональные стволовые клетки – лекарство от старости (3)

(Продолжение. Начало статьи – здесь.)

III. ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В КЛЕТКИ ОПРЕДЕЛЕННЫХ ТИПОВ

Наиболее многообещающей особенностью чЭСК является их способность давать начало тканеспецифичным клеткам-предшественникам, способным к дифференцировке в специализированные постмитотические клетки, пригодные для использования в клеточной терапии. Более того, чЭСК, в силу своей способности к бесконечному делению, представляют собой практически неистощимый источник специфичных популяций клеток. Целью проводимых в настоящее время исследований является поиск и усовершенствование методов направления дифференцировки чЭСК для получения чистых гомогенных популяций клеток определенных типов, пригодных для замещения поврежденных клеток, либо для стимуляции полноценного функционирования окружающих клеток. В следующих разделах мы опишем несколько примеров дифференцировки чЭСК в тканеспецифичные клетки, в частности, обладающие потенциалом для использования в терапии возрастных болезней.

A. Эндодермальные клетки, полученные из чЭСК

К производным эндодермы относятся клетки, формирующие легкие, печень, поджелудочную железу, мочевой пузырь, глотку, щитовидную железу, паращитовидную железу и желудочно-кишечный тракт. Первым этапом создания эндодермальных клеток является формирование дефинитивной эндодермы. D’Amour et al. [29] продемонстрировали, что избирательной индукции формирования дефинитивной эндодермы можно добиться путем добавления высоких концентраций активина А на определенных этапах дифференцировки при условии низкого содержания сыворотки в среде. Действие активина А сходно с действием Nodal – лиганда, активирующего сигнальный механизм, опосредованный трансформирующим фактором роста-бета (TGFβ). Роль активина А в индукции формирования дефинитивной эндодермы усиливается в присутствии дополнительных факторов, таких как Wnt3a [30] и Noggin [31], либо при одновременной супрессии сигнального механизма, опосредованного фосфоинозитид-3-киназой [32].
Индукция формирования дефинитивной эндодермы из чЭСК может приводить к появлению специфичных популяций клеток-предшественников, в том числе предшественников островковых бета-клеток поджелудочной железы, гепатоцитов или клеток альвеолярного эпителия. Конечной целью создания этих клеток является лечение диабета, а также болезней печени и легких, соответственно. К наиболее успешным из существующих на сегодняшний день примеров относится создание предшественников островковых бета-клеток поджелудочной железы, осуществленное Крун и др. (Kroon et al.) [33] посредством последовательного воздействия на чЭСК активина А и Wnt3A с последующим внесением в среду фактора роста кератиноцитов или фактора роста фибробластов-7 для индукции формирования примитивной пищеварительной трубки. После этого в культуру добавляют ретиноевую кислоту, циклопамин и Noggin, что обеспечивает ингибирование опосредуемых белком Sonic Hedgehog (Shh) и TGFβ сигнальных механизмов, индуцирующее дифференцировку клеток задней поверхности передней кишки, являющихся источником панкреатических клеток предшественников. Эти клетки культивируют для получения клеток эндодермы поджелудочной железы. После имплантации иммунодефицитным мышам такие клетки приобретали гистологические и структурные характеристики бета-клеток островков поджелудочной железы и демонстрировали способность продуцировать инсулин в течение, по крайней мере, 100 дней. Эти результаты были восприняты с огромным энтузиазмом, так как они продемонстрировали возможность излечения диабета. Диабет 2 типа является наиболее распространенным вариантом заболевания, от которого страдает более 25% населения США в возрасте 65 лет и старше [34].

Гепатоциты также получают после дифференцировки чЭСК в дефинитивную эндодерму [35, 36]. Популяция высокостабильных функциональных гепатоцитов была получена путем последовательного использования среды с низким содержанием сыворотки, матрикса из коллагена I типа и факторов дифференцировки гепатоцитов, в том числе фактора роста фибробластов, BMP4, фактора роста гепатоцитов, онкостатина М и дексаметазона [36]. Эти клетки экспрессировали известные маркеры зрелых клеток печени, демонстрировали соответствующие их статусу функции и, при введении мышам с повреждениями печени, интегрировались и дифференцировались в зрелые клетки печени. Способность дифференцироваться в клетки печени может быть полезной при лечении ряда заболеваний этого органа, часто развивающихся у людей преклонного возраста, таких как цирроз, печеночно-клеточный рак и ассоциированные с диабетом хронические заболевания печени [37].

Возможность использования чЭСК для лечения травм легких также была объектом исследований. Важное достижение в разработке метода направленной дифференцировки в клетки легких было сделано Ванг и др. (Wang et al.) [38, 39]. В данной работе генетически модифицированные чЭСК, несущие специфичные для клеток легких гены-репортеры под контролем промотеров тканеспецифичных генов, таких как белок сурфактанта C, аквапорин-5 и T1-альфа, формировали чистые популяции альвеолярных эпителиальных клеток I и II типа. При введении мышам с острыми повреждениями легких эти клетки демонстрировали адекватные функциональные свойства, в том числе способность к газообмену и улучшение состояния зоны повреждения на тканевом уровне.

B. Мезодермальные клетки, полученные из чЭСК

Направление дифференцировки чЭСК в мезодерму требует активации сигнального механизма, опосредуемого трансформирующим фактором роста-бета и может осуществляться посредством поэтапного дозозависимого добавления активина А, BMP4 и факторов роста, таких как фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) и базового фактора роста фибробластов (bFGF) [40]. Производные мезодермы также успешно получали путем спонтанной дифференцировки чЭСК через этап формирования чЭТ без первоначального направления их дифференцировки в мезодерму. Устойчивая дифференцировка чЭСК в гемопоэтические стволовые клетки, дающие начало всем типам клеток крови и компонентам иммунной системы, была достигнута при использовании бессывороточной среды путем формирования чЭТ вращения [41]. Специфичные гемопоэтические клетки, такие как функциональные дендритные клетки, успешно получали из чЭСК посредством спонтанного формирования чЭТ в бессывороточной среде и добавления BMP4 на определенных временных этапах [42]. Гемопоэтические клетки-предшественники, превращающиеся в функциональные Т-лимфоциты и натуральные киллеры, специфично воздействующие на человеческие опухолевые клетки как in vitro, так и in vivo, были получены из чЭСК, культивированных совместно со стромальными клетками [43]. Таким образом, возможность дифференцировать чЭСК в гемопоэтические клетки открывает перспективы усовершенствования существующих терапевтических подходов к лечению рака, требующих проведения трансплантации клеток крови, а также методов иммунотерапии, подразумевающих индукцию антиген-специфичных иммунных реакций [44].

Кардиомиоциты, представляющие собой еще одно важное с терапевтической точки зрения производное мезодермы, успешно получали из чЭСК с помощью нескольких методов [45]. В определенных условиях культивирования чЭСК могут спонтанно дифференцироваться в кардиомиоциты через этап формирования чЭТ. Морфологические, молекулярные и электрофизиологические свойства получаемых при этом кардиомицитов аналогичны свойствам взрослых кардиомиоцитов [46], при этом они демонстрируют поддающиеся количественной оценке реакции на физиологические стимулы, сходные с реакциями ткани предсердий, желудочков, а также очага автоматизма/проводимости сердца [47-50]. Кардиомиоциты также получали путем направленной дифференцировки с помощью воздействия активина А и BMP4 на плотный монослой чЭСК. При трансплантации in vivo эти клетки успешно формировали функциональные кардиомиоциты [51]. При проведении еще одного исследования для стимуляции дифференцировки чЭТ в кардиомиоциты использовали дополнительные добавки к питательной среде, в том числе фактор роста сосудистого эндотелия, ингибитор Wnt и гомолог Dickkopf (DKK1), после которых в среду вносили bFGF [52]. Успех данных исследований оценивали путем измерения уровня экспрессии белков, специфичных для зрелых клеток сердца, таких как сердечный тропонин Т, легкая цепь-2 миозина предсердий, а также факторы транскрипции сердечной мышцы Tbx5 и Tbx20. Несколько групп исследователей создали специфичные для сердечной ткани репортерные линии чЭСК, которые можно использовать для тестирования различных стратегий дифференцировки [49, 53] и создания специфичных подтипов кардиомиоцитов [49].

Судя по результатам теста на формирование тератом, дифференцировку чЭСК можно без труда направить в сторону соединительных тканей, таких как кость или хрящ (рис. 3). Поэтому чЭСК могут быть ценным источником клеток, пригодных для заместительной терапии соединительных тканей при таких заболеваниях, как остеоартрит и остеопороз, характеризующихся разрушением суставных хрящей и патологическими переломами, вызванными низкой плотностью костной ткани, соответственно. Наиболее удачные и эффективные протоколы направления дифференцировки чЭСК в хондроциты подразумевают использование трехмерных систем культивирования, что достигается путем высевания чЭСК в высокой плотности, что ведет к формированию плотного сгустка, либо введением клеток в синтетическую трехмерную матрицу. Подобные системы обеспечивают возможность обмена сигналами между недифференцированными чЭСК и зрелыми хондроцитами, что стимулирует стабильную гомогенную хондрогенную дифференцировку. Например, создание одноклеточной суспензии диссоциированных чЭТ, культивированных в виде микромасс высокой плотности в присутствии BMP2, способствует формированию хондроцитов [54]. Совместное культивирование чЭСК с первичными хондроцитами или в присутствии остеогенных добавок и полимерных матриц позволяло получать клетки, сходные с хрящевыми или остеогенными [55, 56]. Совсем недавно применение трехмерных систем культивирования, не подразумевающих использование фидерного слоя, позволило получить из чЭСК мультипотентные клетки-предшественники соединительной ткани, формирующие хрящеподобные структуры. Имплантация этих дифференцировавшихся в условиях in vitro хрящеподобных структур травмированным иммунодефицитным мышам восстанавливала подвижность голеностопных суставов животных, которая возможна только при наличии неповрежденного ахиллова сухожилия [57]. Более того, существуют данные, согласно которым трансплантация клеток способствует росту и восстановлению поврежденных тканей также посредством стимуляции эндогенных клеток [58].

C. Эктодермальные производные чЭСК

Доминирующий механизм дифференцировки культур чЭСК ведет к формированию эктодермы, которая дает начало клеткам нервной системы и эпидермиса. Для полученных из чЭСК нервных клеток-предшественников характерно образование розеткоподобных структур, формирующихся в присутствии FGF2 или EGF посредством спонтанной дифференцировки при перерастании чЭСК или после высевания чЭТ на поверхность адгезивного субстрата [59, 60]. Эти «нейральные розетки» стали маркером получаемых из чЭСК нервных клеток-предшественников, способных, при воздействии соответствующих стимулов, к дифференцировке в широкий спектр нервных клеток. Цель многих исследований – разработка методов стимуляции формирования нейральных розеток для создания обогащенных популяций специфичных типов нервных клеток. Одним из примеров является использование линий стромальных клеток [61], продуцирующих эктодермальные сигнальные факторы, необходимые для индукции формирования нервных клеток, и способствующих формированию нейрональных розеток [62, 63].

Отказ от FGF2 и EGF и применение других факторов может приводить к дифференцировке нейрональных розеток в специфичные подтипы нервных клеток. Полученные из нейрональных розеток стволовые клетки нервного валика могут дифференцироваться, при добавлении BDNF, GDNF, NGF и dbcAMP, в периферические симпатические и чувствительные нейроны или, в присутствии CNTF, нейрегулина-1-бета и dbcAMP, в Шванновские клетки [64]. Нейроглиальные клетки, такие как олигодендроциты, формируются при добавлении B27, гормона щитовидной железы, ретиноевой кислоты, FGF2, фактора роста эпидермиса и инсулина [65]. Кроме того, FGF8 и Shh индуцируют дифференцировку полученных из чЭСК нервных клеток-предшественников в допаминергические нейроны [66], тогда как добавление Shh и ретиноевой кислоты индуцирует их дифференцировку в двигательные нейроны [67]. Недавно из чЭСК, посредством формирования нейросфер и последующего добавления Shh, FGF8 и BMP9 или гиперэкспрессии LHX8 и GBX9, были получены функциональные холинергические нейроны базальных отделов головного мозга [68].

Возможность дифференцировать чЭСК в нервные клетки и другие клетки нервной системы вызвала большой интерес, так как такие клетки можно использовать для тестирования препаратов или для заместительной клеточной терапии ряда нейродегенеративных заболеваний. В частности, успешное выращивание допаминергических нейронов, в особенности относящихся к формирующему средний мозг подтипу, потенциально можно использовать для лечения болезни Паркинсона, характеризующейся прогрессивной гибелью и нарушением функционирования этих нейронов. Полученные из чЭСК холинергические нейроны можно также использовать для терапии болезни Альцгеймера, при которой дегенерация холинергических нейронов базальных отделов головного мозга приводит к вызывающим инвалидность нарушениям познавательной функции. Однако чЭСК можно использовать и не прибегая к методам заместительной терапии. При проведении клинического исследования, в рамках которого аутологичные фибробласты, запрограммированные на экспрессию человеческого NGF, имплантировали в передний мозг пациентов с болезнью Альцгеймера умеренной выраженности, наблюдалось значительное снижение скорости ухудшения познавательной функции [69]. Таким образом, теоретически полученные из чЭСК генетически модифицированные нервные клетки-предшественники, способные быстро приживаться и продуцировать белковые продукты терапевтических генов, такие как NGF, можно использовать для профилактики дегенерации холинергических нейронов базальных отделов головного мозга.

Аналогичным образом, полученные из чЭСК двигательные нейроны можно использовать в терапии бокового амиотрофического склероза (БАС), характеризующегося прогрессивной утратой двигательных нейронов коры и ствола головного мозга, а также спинного мозга. Результаты изучения моделей БАС также указывают на то, что вспомогательные клетки нервной ткани, такие как олигодендроциты и шванновские клетки, могут вносить свой вклад в развитие данного заболевания [70, 71]. Поэтому возможность дифференцировать чЭСК как в нейроны, так в и другие типы клеток центральной нервной системы выглядит многообещающим терапевтическим подходом.

Эффективность трансплантации полученных из чЭСК олигодендроцитов для лечения повреждений спинного мозга в настоящее время изучается в рамках первого клинического исследования с использованием чЭСК, получившего одобрение Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США [72]. Повреждения спинного мозга приводят к быстрой утрате олигодендроцитов, что ведет к демиелинизации и гибели нейронов. В рамках клинического исследования, спонсируемого корпорацией Geron, очищенные клетки-предшественники олигодендроцитов вводят в спинной мозг парализованных пациентов в течение двух недель после получения травмы. Это первое клиническое исследование ориентировано на изучение безопасности такой терапии, но ожидается, что клетки-предшественники пройдут необратимую дифференцировку в олигодендроциты и начнут продуцировать миелин, изолирующий мембраны нервных клеток и необходимый для эффективной передачи нервных импульсов. Если при проведении данного исследования удастся добиться успешной интеграции и функционирования олигодендроцитов, его результаты могут лечь в основу новых методов лечения БАС, проявляющегося демиелинизацией двигательных нейронов.

Клетки пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) являются еще одним специфическим типом клеток, получаемым из нейроэктодермы. Клетки ПЭС поддерживают функционирование нервных клеток сетчатки путем фагоцитоза и обновления пигмента родопсина внешних сегментов фоторецепторов. Согласно недавно опубликованным данным, дифференцировку чЭСК в клетки ПЭС можно индуцировать присутствием в бессывороточной среде никотинамида и активина А [73]. После трансплантации в животную модель макулярной дегенерации – заболевания, вызываемого нарушением функционирования и гибелью клеток ПЭС – полученные из чЭСК пигментированные клетки приобретают морфологические и функциональные характеристики клеток ПЭС. Эти данные легли в основу второго и третьего клинических исследований с использованием чЭСК, получивших одобрение Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США и спонсируемых компанией Advanced Cell Technology. В рамках этих исследований полученные из чЭСК клетки ПЭС с целью восстановления остроты зрения будут имплантировать непосредственно в разрушающуюся сетчатку пациентов с макулярной дегенерацией Штаргардта – юношеской формой заболевания – или с сухой формой возрастной макулярной дегенерации. Начало этих трех клинических исследований является рубежом переноса результатов исследовательской работы с чЭСК в практику лечения дегенеративных заболеваний и специалисты областей биологии стволовых клеток и гериартрической медицины с огромным нетерпением ожидают результатов.

Продолжение: современные проблемы терапевтического использования клеток, полученных из человеческих эмбриональных стволовых клеток, и возможные пути решения.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru

19.12.2011

назад

Читать также:

Остановить болезнь Альцгеймера

Ученые института Солка синтезировали препарат, предотвращающий прогрессирование болезни Альцгеймера. А финские исследователи надеются, что в течение ближайших 3 лет их методика раннего выявления этого заболевания будет введена в практику.

читать

Что такое катаракта и как с ней бороться

Катаракту многие считают неизбежным спутником возраста. Но благодаря развитию современных медицинских технологий с этой проблемой сегодня можно успешно бороться и восстанавливать зрение практически до 100%.

читать

Диабет – удар по мозгу

Многочисленные осложнения диабета, такие как болезни почек, трофические язвы на ногах и проблемы со зрением, хорошо известны. Однако оказалось, что это заболевание губительно сказывается еще и на мозге человека.

читать

Новые старые

По сравнению со своими ровесниками, жившими 30 лет назад, современные старики чаще занимаются сексом, чаще разводятся, демонстрируют более выдающиеся умственные способности и, в целом, чувствуют себя лучше.

читать

Как проверить «таблетки от старости»: возрастные болезни – маркер старения

Как оценить эффективность замедляющих старение препаратов без проведения клинических исследований длиной в жизнь человека с участием здоровых людей?

читать