Семь раз отмерь

Что может быть не так с отредактированными зародышами человека

Полина Лосева, «Чердак»

В начале августа международный коллектив ученых отчитался об успешном редактировании человеческого эмбриона: удалось вырезать мутантную копию гена, отвечающего за наследственную болезнь сердца. Однако не прошло и месяца, как начали появляться опровержения: другая группа ученых предлагает аккуратнее относиться к полученным результатам и требует более подробных доказательств. Разбираемся в том, что могло пойти не так.

Эксперимент по редактированию эмбрионов возник не на пустом месте: ему предшествовала долгая отработка методики на зародышах мыши и человека. Однако именно группе ученых под руководством Шухрата Миталипова удалось добиться нужного результата: большинство полученных зародышей не содержали мутаций ни в одной из клеток. Вот их рецепт «починки человека»:

1. Берем зрелую яйцеклетку с нормальной копией гена и сперматозоид с мутантной копией гена.

2. Вкалываем в яйцеклетку ядро сперматозоида (как при экстракорпоральном оплодотворении). Туда же вкалываем Cas9 – фермент, способный разрезать ДНК. И, наконец, добавляем зонд – участок РНК, комплементарный (то есть способный прилипнуть) к мутантной версии гена.

3. Ждем. В это время зонд прилипает к мутантному гену в ядре сперматозоида, а Cas9 вырезает его по концам из обеих цепей ДНК. В одной из хромосом сперматозоида получается сквозная дырка.

4. Ждем еще три дня. За это время зародыш успевает несколько раз поделиться, теперь в нем 4–8 клеток.

5. Берем каждую клетку в отдельности, выделяем из нее ДНК и проверяем, какая версия гена там содержится.

В эксперименте группы Миталипова 72% зародышей получились полностью здоровыми (несущими только нормальную копию гена), а остальные 28% – гетерозиготами (несущими обе копии гена).

Мы не можем знать наверняка, что именно произошло в оплодотворенных зародышах: превращения ДНК не видно в микроскоп, остается только догадываться. Поэтому возможны разногласия в объяснении произошедшего. По мнению авторов исследования, раз мутантных последовательностей в большинстве эмбрионов не обнаружено, следовательно, Cas9 их вырезала и клетки от них избавились. Что касается образовавшихся дырок в хромосомах, возможны два варианта: либо края дырок случайным образом сшиваются (но при этом часто утрачивается часть прилежащего генетического материала) – так называемое негомологичное соединение концов, либо на помощь приходит целая хромосома (в данном случае материнская) – происходит репарация по гомологии. То есть материнская хромосома разъединяется на две нити в той области, где находится исследуемый ген, и информация с гена копируется на отцовскую хромосому. В результате обе хромосомы несут здоровую копию гена, и если это так, то редактирование генома можно считать успешным. Авторы полагают, что в зародышах имел место именно этот второй механизм.

Типы репарации двунитевых разрывов в ДНК. Синее и черное – гомологичные хромосомы. В областях разрыва цветами отмечены белки репарации. Изображение: Hannes Lans et all., 2012.

Но у группы ученых из США и Великобритании другая точка зрения на произошедшее, о чем они пишут на сайте Biorxiv (хотя этот сайт не рецензируется учеными, поэтому представленные на нем материалы теоретически могут содержать недостоверную информацию, но в данном случае авторы высказывают вполне логичные замечания к оригинальному исследованию):

Репарация по гомологии довольно редко встречается у человека. До недавнего времени вообще считалось, что в клетках человека этот механизм не работает, пока его не обнаружили в опухолевых клетках. Миталипов и соавторы сами в своей статье отмечают, что стволовые клетки, на которых они проверяли методику эксперимента, практически не использовали одну хромосому для починки другой.

Насколько сейчас известно, материнское и отцовское ядра (а точнее, пронуклеусы, предшественники ядер) сильно разнесены в пространстве зиготы. Они не сливаются и не образуют общее ядро, а непосредственно переходят к первому делению. Сначала они удваиваются, все еще находясь на разных полюсах, и сближаются лишь потом, когда хромосомы выстраиваются по центру клетки, образуя веретено деления. Поэтому неясно, когда материнская хромосома могла бы оказаться настолько близко к отцовской, чтобы «помочь» ей залатать дыру.

Таким образом, ученые-критики ставят под сомнение вывод группы Миталипова. Если репарация за счет гомологии маловероятна, то растут шансы того, что произошло негомологичное соединение концов и мутантный ген просто потерян. А это уже нельзя считать редактированием эмбриона.

На некоторые из этих комментариев ответ обнаруживается в самой оригинальной статье. Авторы исследования полагают, что в половых клетках и зиготе работают уникальные механизмы починки ДНК, не характерные для остальных клеток организма. Они связывают это с тем, что ДНК в половых клетках представляет особенную ценность и необходимо чинить ее поломки без потери материала. В то же время они ничего не говорят о проблеме сближения отцовского и материнского пронуклеусов.

Есть еще один способ выяснить, как все было на самом деле, – доказать непосредственно, что разрыв хромосомы был восстановлен тем или иным путем. Для этого авторы оригинальной статьи проанализировали последовательности ДНК, расположенные вблизи хромосомной дыры. Если бы клетки для починки разрыва использовали негомологичное соединение концов, то соседние последовательности с большой вероятностью пострадали бы. Однако в отредактированных зародышах поврежденных последовательностей обнаружено не было. Из этого авторы заключили, что дело именно в использовании материнской хромосомы.

Однако в опровергающей статье этот вывод вызывает сомнения. Ученые-критики пишут о том, что при негомологичном соединении концов повреждение могло затронуть более длинные участки хромосом, чем те, которые отслеживали в ходе эксперимента. И если отцовская хромосома такой участок потеряет, то он сохранится в клетке только в одном экземпляре – в материнском. А при дальнейшем анализе получится, что все в порядке, ведь материнский участок на месте, а отцовского просто нет.

«Мы признаем, что эти результаты должны быть подтверждены дополнительными исследованиями, и призываем других ученых воспроизвести наши открытия», – рассказал Шухрат Миталипов в письме «Чердаку». Тем не менее, он продолжает придерживаться своей позиции. «Наши открытия и выводы основаны на тщательно продуманном эксперименте, проведенном на сотнях эмбрионов человека. Критика… не содержит никаких новых результатов, но, напротив, опирается на альтернативное объяснение наших результатов, основанное на чистой спекуляции», – сообщил ученый. Сейчас Миталипов готовит подробный научный ответ по этим вопросам.

Ключевые вопросы, возникшие в ходе этой дискуссии, являются принципиальными, несмотря на кажущуюся сложность. Речь идет не только о молекулярных механизмах, работающих в данном конкретном случае, а о возможном прорыве в области репродуктивных технологий. Если методика группы Миталипова окажется успешной и безопасной, с ее помощью можно будет избавлять детей от наследственных заболеваний. Однако если их результаты действительно противоречивы, то подобные манипуляции представляются крайне рискованными. Например, если при негомологичном соединении концов теряется большой участок отцовской хромосомы, то далее зародыш несет только материнскую копию этого участка. Но что если эта материнская копия бракованная? Последствия для организма могут быть непредсказуемы. Риск велик, но высоки и ставки. Будем с нетерпением ждать развития событий на новом фронте репродуктивных технологий.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru 12.09.2017