Коррекция генома с точностью до нуклеотида
Исследователи Массачусетского технологического института, института Броада (Broad Institute) и университета Рокфеллера разработали новую методику, позволяющую с высокой степенью точности изменять геномы живых клеток путем добавления или удаления генов. Они утверждают, что новая технология предоставляет новый, легкий в применении и сравнительно дешевый метод модификации организмов для производства биотоплива, создания животных моделей для изучения заболеваний человека, разработки новых методов терапии и множества других целей.
Первые генетически модифицированные мыши были созданы в 1980-х годах путем введения небольших фрагментов ДНК в ядра мышиных эмбриональных клеток. В настоящее время этот метод широко используется для создания трансгенных животных, выступающих в качестве моделей для изучения заболеваний человека. Однако он имеет один серьезный недостаток – фрагменты ДНК встраиваются в геном случайным образом.
В последние годы специалисты разработали новые более точные методы модификации генома. Один из них, известный как гомологичная рекомбинация, подразумевает использование фрагмента ДНК, помимо гена-мишени содержащего последовательности, соответствующие региону генома, в который необходимо встроить интересующий ученых ген. Однако вероятность успеха этой процедуры очень низка, так как в нормальных клетках рекомбинация ДНК происходит очень редко.
Совсем недавно биологи научились повышать эффективность этого процесса с помощью разрезающих ДНК ферментов – нуклеаз. Для доставки нуклеаз в нужные регионы генома обычно используются белковые комплексы, известные как «цинковые пальцы», однако они не могут воздействовать на все возможные последовательности ДНК, что ограничивает область их применения. Более того, синтез этих белков очень трудоемок и требует больших финансовых затрат.
Для разрезания ДНК в определенных регионах можно также использовать подобные активаторам транскрипции эффекторные нуклеазы (transcription activator-like effector nucleases, TALENs), однако синтез этих комплексов также сложен и затратен.
Разработанная авторами система гораздо более приемлема с практической точки зрения. Она основана на использовании естественных бактериальных комплексов, состоящих из белков и РНК. Эти комплексы защищают бактериальные клетки от вторжения вирусов путем распознавания и разрезания вирусной РНК. Взяв за основу эти структуры, исследователи создали модифицирующие ДНК комплексы, представляющие собой нуклеазу Cas9, связанную с короткими цепочками РНК. Эти последовательности соединяются комплементарными последовательностями ДНК, а Cas9 разрезает их в указанном месте.
Этот подход можно использовать как для блокирования работы того или иного гена, так и для его замещения необходимым генетическим вариантом. Для замещения гена в комплекс вводится необходимая последовательность ДНК, которая копируется в место разреза.
Точность нового метода исключительно высока. Активации нуклеазы не происходит даже при различии последовательностей ДНК генома и направляющей РНК на одну пару нуклеотидов. Эффективность и стоимость разработки также выгодно отличают ее от использовавшихся ранее подходов.
Разработчики разместили все необходимые для создания системы генетические компоненты в некоммерческом фонде плазмид Addgene, предоставив всем коллегам возможность использования нового метода. Они также создали веб-сайт, на котором представлены рекомендации и советы по применению методики.
Помимо прочего, предложенную систему можно использовать для разработки новых методов лечения заболеваний, причиной развития которых является дефект в одном гене, таких как болезнь Гентингтона. В настоящее время уже ведутся клинические исследования терапевтических подходов, заключающихся в блокировании активности определенных генов с помощью «цинковых пальцев». Новая технология потенциально является более эффективной альтернативой.
Она может также оказаться полезной в лечении ВИЧ путем выделения лимфоцитов пациента и изменения их гена, кодирующего рецептор CCR5, являющийся «входными воротами» для вируса. После введения обратно пациенту такие модифицированные клетки будут предотвращать развитие заболевания.
Еще одной областью применения новой технологии является изучение заболеваний человека путем индуцирования определенных мутаций в геноме стволовых клеток. Последующая трансформация таких клеток в кардиомиоциты или нейроны позволит изучать влияние мутаций на биологию специализированных клеток.
Статьи Mali et al., RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9 (полный текст – на странице Church Lab на сайте Гарвардского университета) и Cong et al., Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems (полный текст – на странице Zhang Lab @ MIT) опубликованы в журнале Science.
Евгения Рябцева
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru по материалам MIT: Editing the genome with high precision.
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru
14.01.2013