Вирус против глиобластомы
Вектор на основе AAV9 проникает в мозг мышей и приматов при внутривенном введении
Ирина Конова, PCR.news
Генотерапевтические векторы на основе аденоассоцированных вирусов (AAV), нацеленные на борьбу с заболеваниями центральной нервной системы, удобнее всего было бы вводить системно, так как спинной и головной мозг богаты сосудами. Однако на пути векторов встает серьезное препятствие — гематоэнцефалический барьер. Некоторые AAV, например, AAV9, имеют природную способность преодолевать ГЭБ.
Ученые используют различные подходы для повышения эффективности доставки векторов в ЦНС, однако не всегда результаты, достигнутые на мышах, воспроизводятся на приматах. В новой работе команда из США оптимизировала AAV9, используя проникающие в клетку пептиды (cell-penetrating peptides, CPP). Полученные варианты вектора протестировали на мышах и макаках-крабоедах.
CPP — это группа коротких пептидов, способных пересекать биологические мембраны и облегчать транспорт в клетку молекул, которые иначе не могут в нее попасть. Ученые предположили, что с помощью размещения тех или иных CPP на поверхности капсида AAV9 можно модулировать тканевый тропизм вектора. Они протестировали 14 CPP. Генетическую последовательность пептидов встраивали в последовательность рецептор-связывающего региона капсида. Кроме того, на вектор поместили ген красного флуоресцентного белка (RFP), который использовали в качестве репортера.
Девять из 14 вариантов AAV не дали достаточных вирусных титров in vitro. Способность оставшихся пяти пересекать ГЭБ проверили на мышах. В качестве контроля использовали исходный AAV9, модифицированный RFP. Мышам внутривенно вводили один из вариантов AAV, и через три недели исследовали их мозг. Два вектора, AAV.CPP.11 и AAV.CPP.12, продемонстрировали повышенную способность проходить через ГЭБ по сравнению с AAV9. Они несли CPP Bip1 и Bip2, соответственно. Эти молекулы относятся к семейству 5-мерных Bax-ингибирующих пептидов, полученных из белка Ku70. Ученые модифицировали последовательности этих пептидов, добавляя и переставляя местами аминокислоты и повышая таким образом тропизм вектора к клеткам мозга. Итоговые варианты, AAV.CPP.16 и AAV.CPP.21, проходили через ГЭБ мышей различных линий при внутривенном введении в десятки и сотни раз эффективнее, чем AAV9. При этом, как показали эксперименты на клетках, векторы не подавляли экспрессию проапоптотического гена Bax, несмотря на происхождение CPP.
На следующем этапе ученые проверили AAV.CPP.16 и AAV.CPP.21 на молодых и взрослых макаках-крабоедах. В эксперименте участвовали девять обезьян с предварительно подтвержденным отсутствием нейтрализующих антител к AAV9. В качестве репортера вместо флуоресцентного белка взяли человеческую декарбоксилазу ароматических аминокислот (hAADC), так как она не вызывает иммунного ответа у низших приматов. Репортер в клетках мозга визуализировали с помощью иммуноокрашивания. Лучшие результаты продемонстрировал AAV.CPP.16. Он проходил через ГЭБ примерно в пять раз лучше, чем исходный AAV9, и одинаково хорошо работал у молодых и взрослых макак.
Затем ученые вернулись к мышам. На мышиной модели глиобластомы они показали, что AAV.CPP.16 при внутривенном введении может проносить через ГЭБ терапевтическую нагрузку — последовательность вариабельного фрагмента антитела к мышиному PD-L1. Мышам прививали опухолевые клетки и через пять дней вводили вектор. С помощью иммуноанализа, проведенного на 19 день эксперимента, ученые подтвердили экспрессию терапевтической молекулы в клетках опухоли. Кроме того, они наблюдали иммуномодулирующий эффект блокады PD-L1 и повышенную выживаемость мышей, получивших терапевтический вектор.
Таким образом, авторы получили вектор на основе AAV9, эффективно проникающий в мозг мышей и приматов. Они планируют совершенствовать его и дальше, в частности, более строго ограничить его тропизм (в эксперименте на модели глиобластомы терапевтическая молекула обнаруживалась также в печени и мышцах мышей).
Статья Yao et al. Variants of the adeno-associated virus serotype 9 with enhanced penetration of the blood–brain barrier in rodents and primates опубликована в журнале Nature Biomedical Engineering.
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru