Двухфотонная микроскопия мозга
Мини-микроскоп ведет «репортаж» из мозга в прямом эфире
Одна из главных задач современной неврологии – разобраться, как функционирование головного мозга соотносится с работой разных групп его главных клеток – нейронов. И благодаря последним разработкам в области микроскопии мы теперь можем в реальном времени наблюдать, как «диалог» нейронов рождает намерение, которое реализуется в конкретном поведенческом действии.
Одна из современных технологий изучения работы мозга – это оптическая визуализация с помощью методов генетики и микроскопии. Используют их, по понятным причинам, на лабораторных животных, в первую очередь мышах и крысах.
К примеру, активность отдельных нейронов, находящихся в поле зрения микроскопа, можно определить по изменениям концентрации внутриклеточного кальция. При этом способе визуализации специальная метка связывается со свободным кальцием цитоплазмы и начинает флуоресцировать. А чтобы заставить клетки мозга светиться во время работы, в их геном встраивают позаимствованный у медузы ген, кодирующий фермент люциферазу, которая при добавлении специфического субстрата запускает процесс биолюминесценции. Кроме того, популяции функционально различающихся нейронов можно по-разному «окрашивать» благодаря их молекулярной специфике, и по межнейронному взаимодействию судить, как осуществляются те или иные когнитивные функции.
Что касается микроскопических методов исследования, то сначала для визуализации поведения грызунов стали применять стационарные двухфотонные лазерные сканирующие микроскопы, при этом голову особи с удаленным фрагментом черепа фиксировали под объективом. Но в этом случае животное очень ограничено в движениях, а чтобы отследить работу нейронов при сложном поведении, оно должно вести себя естественно.
Двухфотонная микроскопия – метод изучения микрообъектов с помощью оптического микроскопа, в котором флуоресценция объекта инициируется одновременным поглощением двух фотонов, энергии каждого из которых недостаточно для возбуждения флуоресценции. Высокая локализация возбуждения и применение низкоэнергетических фотонов позволяет проводить исследования образцов на большой фокусной глубине (до 1 мм) с высоким контрастом и предохраняет их от разрушения под действием света.
Двухфотонная микроскопия мозга мыши. Слева – нейроны, окрашенные чувствительным к кальцию зеленым красителем, справа – нейроны трансгенной мыши, производящие зеленый флуоресцентный белок. Сосуды окрашены «техасским красным».
Нужны были миниатюрные приборы, которые можно было бы закрепить на голове свободно передвигающихся грызунов. Но первые двухфотонные минископы 2P (е) имели много недостатков, таких как большой вес и негибкие оптические кабели, а из-за медленного сканирования изображение искажалось. Прорыв произошел с появлением маленьких и легких однофотонных (1P) минископов. Однако с их помощью нельзя было получать трехмерное изображение.
Недавно ученые из Института системной нейробиологии им. Кавли и Центра нейронных вычислений Норвежского университета науки и технологий (Тронхейм, Норвегия) протестировали образец миниатюрного 2P-устройства нового поколения, названного Mini2P, который лишен многих недостатков предыдущих версий.
Статья Moser et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice опубликована в журнале Cell.
Изображение кровеносных сосудов мозга мыши, полученное с помощью двухфотонной флуоресцентной микроскопии. Разные цвета отражают глубину от поверхности коры мозга до 1 мм.
Mini2P может одновременно записывать работу тысяч клеток и обеспечивает стабильную визуализацию работы мозга мыши. Весит он менее 3 г, поэтому не мешает грызуну бегать, прыгать, лазать, т.е. вести обычную мышиную жизнь. Закрепленный на голове животного, благодаря проделанному в черепе отверстию Mini2P показывает «в прямом эфире» работу мозга свободного активного животного.
С помощью Mini2P ученые уже визуализировали работу популяций нейронов зрительной коры, гиппокампа, играющего важную роль в работе памяти, в том числе, пространственной, а также медиальной энторинальной коры – связующего звена между гиппокампом и корой головного мозга.
Двухфотонная микроскопия мозга мышиной модели болезни Альцгеймера. Патологический белок-амилоид окрашен синим, нейроны трансгенной мыши, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок, – зеленым, кровеносные сосуды – красным.
Имея в своем распоряжении такой мини-микроскоп, ученые могут продвинуться в понимании природы заболеваний головного мозга. Так, болезнь Альцгеймера часто начинается с повреждения энторинальной коры – важнейшего центра памяти головного мозга, что сопровождается проблемами с запоминанием и со способностью к ориентации. Используя мышей, служащих животной моделью болезни Альцгеймера, с помощью Mini2P можно отследить в динамике изменения поведения нейронов и понять, какие из них наиболее уязвимы перед патологическим процессом.
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru