Липосомы на самообслуживании

Создан прототип клетки, способный синтезировать компоненты собственной мембраны

Анна Гусева, «Элементы»

Рис. 1. Искусственная клетка – синтетическая биополимерная капсула, в которую заключены молекулы, выполняющие определенные функции. Минимальный набор компонентов искусственной клетки включает в себя клеточную мембрану, молекулы – носители информации (ДНК или РНК) и систему, позволяющую клетке производить белки. Хотя полноценные искусственные клетки еще не созданы, ученые активно работают в этом направлении. Рисунок с сайта cell-free.org.

Для решения многих биотехнологических задач уже давно и успешно используются живые клетки. Но клетка – очень сложная система. Ее поведение зависит от внешних условий, поэтому она не всегда подчиняется инструкциям ученых, которые пытаются превратить клетку, например, в фабрику по производству лекарств. Поэтому биотехнологи стараются разработать искусственные аналоги клеток, содержащие минимально возможный набор генов, служащих конкретной цели. Ученые из Нидерландов сделали важный шаг к решению этой задачи: они создали прототип клетки, синтезирующий липиды, из которых состоит его мембрана.

Термин «биотехнология» возник только в XX веке, но можно считать, что развитие этой дисциплины началось еще в древности, когда люди впервые начали готовить хлеб, вино, сыр и другие продукты, в которых используются микроорганизмы. Настоящий прорыв в развитии биотехнологий произошел в 70-х годах XX века, когда ученые научились напрямую изменять ДНК живых организмов. С тех пор генетически модифицированные клетки бактерий, растений и животных нашли много полезных применений. В качестве удачных примеров можно привести организмы, синтезирующие лекарства и биотопливо. Так, бактерия Escherichia coli, «запрограммированная» на синтез инсулина, помогла наладить широкое промышленное производство этого гормона, обеспечив больных диабетом необходимым лекарством по доступной цене. А ацетогенные бактерии (микроорганизмы, выделяющие ацетат в процессе анаэробного дыхания) были приспособлены для производства этанола, ацетона и бутанола, которые используются в качестве компонентов топлива.

Но не все попытки превратить клетки в живые фабрики или адаптировать их для других применений оказались такими успешными. Дело в том, что кроме выполнения генетической программы, которую ученые добавляют в клетку (например, инструкции «Синтезируй инсулин!»), клетка одновременно следует сотням других указаний от собственного генетического аппарата («Размножайся!», «Ищи еду!», «Защищайся от опасности!»). Эти параллельные процессы могут помешать ей делать то, что нужно ученым. Более того, в течение своей жизни клетка может мутировать или неожиданным образом изменять наши инструкции. А для применения таких клеточных машин, например, в медицине, требуется высокая надежность и гарантия от всяких неожиданностей.

Альтернатива использованию живых клеток – создание упрощенных их аналогов, которые вместо полного генома содержат только небольшую коллекцию необходимых генов. Одним из первых примеров такого подхода стали бесклеточные системы. Они представляют собой экстракты, содержащие всё необходимое для синтеза белка: рибосомы, полимеразы и другие составляющие транскрипции и трансляции (Y. Lu, 2017. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world). Компоненты бесклеточных систем могут храниться в растворе либо в лиофилизированном (замороженном и высушенном) виде. Если смешать растворы в определенных пропорциях или добавить воду к высушенным компонентам, а потом добавить ДНК, то очищенные белки примутся за выполнение закодированных в генах инструкций.

Бесклеточные системы часто используются для изучения регуляции активности генов, для синтеза модифицированных белков и для создания биосенсоров – биологических систем, которые могут, например, обнаружить токсичные вещества в воде или измерить уровень определенных микроэлементов в образце крови (A. Tinafar et al., 2019. Synthetic Biology Goes Cell-Free). Но недостаток бесклеточных систем в том, что они не могут самостоятельно расти и размножаться и не имеют барьера, отделяющего и защищающего их от внешней среды. Это значит, что бесклеточные системы сложно использовать вне лаборатории: в отличие от живых клеток, они не могут регенерировать и быстро выходят из строя в неблагоприятных условиях.

Чтобы сделать бесклеточную систему более похожей на клетку, можно окружить ее мембраной. Клеточная мембрана состоит из белков и липидов – молекул, которые не растворяются в воде, а группируются вместе, образуя двойной слой, защищающий содержимое клетки от внешней среды. Некоторым исследователям уже удалось создать мембранные капсулы, содержащие бесклеточные системы. В одной из первых работ по этой теме ученым из Принстонского университета удалось заключить в оболочку из липидов компоненты для производства зеленого флуоресцентного белка (V. Noireaux, A. Libchaber, 2004. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly). В другом исследовании были созданы липидные капсулы, содержащие гены для производства белков, способных уничтожать раковые клетки (N. Krinsky et al., 2018. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors). Эти результаты могут иметь интересные применения – например, такие капсулы можно ввести в область опухоли, чтобы они локально производили лекарство. Но как сделать так, чтобы искусственные клетки могли регенерировать – увеличиваться в объеме, а впоследствии и делиться, создавая свои копии? На этот вопрос попытались ответить исследователи из Делфтского технического университета в Нидерландах.

Авторы статьи, опубликованной недавно в журнале Nature Communications, решили создать искусственную клетку, которая умеет синтезировать два вида липидов, часто встречающихся в мембранах бактерий: фосфатидилэтаноламин и фосфатидилглицерол. В качестве исходных компонентов для синтеза липидов они использовали молекулы глицераль-3-фосфат и ацетил-КоА.

Преобразование исходных компонентов синтеза в фосфолипиды происходит в несколько этапов. За каждый из них отвечает специальный фермент. Исследователи создали мини-геном с генами, необходимыми для производства этих ферментов (рис. 2).

Рис. 2. Синтез фосфолипидов с помощью ферментов, закодированных в мини-геноме искусственной клетки. Мини-геном содержит семь генов, необходимых для синтеза фосфатидилэтаноамина (PG) и фосфатидилглицерола (PE). Ферменты встраиваются в мембрану липосомы, где и происходит синтез новых липидов. Основные продукты реакций выделены жирным шрифтом, а названия ферментов выделены цветом. Ферменты, принимающие участие в реакции: глицерол-3-фосфат-ацилтрансфераза (PlsB), лизофосфатидная кислота-ацилтрансфераза (PlsC), интегральный мембранный белок CdsA, CDP-диацилглицерол-глицерол-3-фосфат-3-фосфатидил трансфераза (PgsA), фосфатидилглицерол фосфатазы A, B, C (PgpA, PgpB, PgpC). Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature Communications.

В смесь, содержащую копии генома, добавили компоненты бесклеточной системы и заранее подготовленные липиды. Они формируют липидные пузырьки (липосомы) – каркасы, к которым будут присоединяться новые липиды, созданные ферментами. В результате в смеси образовались липидные пузырьки, содержащие мини-геном и всё необходимое для экспрессии генов (рис. 3). Стоит отметить, что копии генома случайно распределяются в растворе. Часть из них оказывается внутри пузырьков, а часть – вне. Но так как пузырьки занимают значительную часть объема раствора, многие из них оказываются начиненными всеми нужными компонентами.

Рис. 3. Схема эксперимента по созданию искусственных клеток, синтезирующих липиды – компоненты мембран. В смесь добавляют копии генома, липиды, компоненты бесклеточной системы и исходные молекулы для синтеза липидов. В результате образуются липосомы, содержащие ферменты, которые производят новые липиды (синие). Из-за случайного распределения компонентов часть реакций может проходить вне липосом.

Чтобы проверить, работает ли их идея, авторы заменили один из атомов углерода в исходных молекулах на более тяжелый изотоп этого элемента. Это помогло им отличить новые липиды от уже присутствующих в липосомных каркасах. Затем они применили метод масс-спектрометрии, который позволяет идентифицировать молекулы на основе информации об их весе и заряде. Результаты этого эксперимента показали, что в смеси действительно образовались новые липиды.

Но вопрос об эффективности искусственных клеток оставался открытым. В описанном выше эксперименте измерялся общий уровень новых липидов в смеси и не учитывалось, какая доля всех реакций происходила внутри липосом, а какая – вне. После того как липосомы сформировались, авторы добавили к смеси ферменты протеазу и ДНКазу, которые разрушают белки и ДНК, не защищенные липосомами. Это помогает избежать синтеза липидов вне липосом.

Для подтверждения того, что белки теперь находятся только внутри искусственных клеток, исследователи пометили их мембраны красным флуоресцентным белком и добавили ДНК желтого флуоресцентного белка (рис. 4). Как и копии мини-генома, эти ДНК случайно распределялись в смеси. Желтый сигнал указывал на области локализации белка, помогая удостовериться, что белки вне липосом были уничтожены. Измерения концентрации новых липидов, сделанные исключительно в липосомах, показали, что синтез имеет высокую эффективность: 40% исходных продуктов были успешно преобразованы в липиды.

Рис. 4. Изображение липосом, полученное с помощью флуоресцентной микроскопии. Мембраны липосом помечены красным флуоресцентным белком (они выглядят как фиолетовые колечки). К реакции была добавлена ДНК желтого флуоресцентного белка. Без добавления протеазы и ДНКазы экспрессия генов происходит как внутри, так и вне липосом (слева). При наличии протеазы (в центре) или ДНКазы (справа) экспрессия генов локализуется внутри липосом. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature Communications.

На следующем этапе авторы попробовали ответить на несколько важных вопросов: какой процент липосом производит новые липиды? Как быстро происходит синтез? Насколько липосомы отличаются друг от друга? Чтобы проследить за синтезом новых липидов, исследователи использовали зеленый флуоресцентный белок. С его помощью они создали маркер, который прикреплялся к мембране липосом в том месте, где появлялся новый липид (рис. 5). По мере синтеза новых липидов мембраны липосом начинали флуоресцировать зеленым.

Рис. 5. Выявление липосом, синтезирующих новые липиды. Флуоресцентная проба прикрепляется к мембране в том месте, куда встроились новые липиды. По мере их синтеза яркость флуоресценции увеличивается, позволяя выявить «активные» липосомы. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature Communications.

Авторы проследили, как флуоресценция отдельных липосом меняется со временем. Они заметили, что яркость постепенно увеличивается и достигает своего максимального значения после 16 часов (рис. 6, слева). Но оказалось, что только около половины липосом производили новые липиды (рис. 6, справа). Это происходит потому, что компоненты, нужные для синтеза, не попали в некоторые липосомы. Хотя 50% – хороший результат для первой попытки, в дальнейшем авторы надеются повысить эффективность своей технологии.

Рис. 6. Слева – динамика синтеза фосфолипидов и присоединения флуоресцентной пробы. Наблюдения с помощью флуоресцентной микроскопии позволяют проследить за синтезом липидов в реальном времени. Флуоресцентная проба прикрепляется к мембране в том месте, куда встроились новые липиды. Увеличение яркости зеленого флуоресцентного белка соответствует увеличению концентрации новых липидов в мембране. Справа – распределение липосом, производящих новые липиды. Анализ полного изображения позволяет определить процент липосом, которые синтезируют новые липиды. Изображения из обсуждаемой статьи в Nature Communications.

На следующем этапе исследователям нужно будет найти способ создания искусственной клетки, которая умеет значительно увеличиваться в объеме и делиться. Для этого они предлагают улучшить бесклеточную систему и увеличить концентрацию ферментов, производящих липиды. А когда клетка достигнет нужного объема, деление произойдет автоматически (такой редкий механизм деления есть у некоторых бактерий, см. R. Mercier et al., 2013. Excess Membrane Synthesis Drives a Primitive Mode of Cell Proliferation). Этот процесс можно будет регулировать с помощью температурных колебаний, провоцирующих деформацию мембраны.

Результаты, описанные в обсуждаемой статье, – важный шаг в работе над созданием полноценной искусственной клетки. Они показывают, что всю цепочку реакций, нужных для синтеза мембранных липидов, можно поместить внутрь липосом. Кроме того, дизайн искусственной клетки, созданный авторами, можно использовать как платформу для производства разных типов липидов, полезных в фармацевтике и промышленности: компонентов мазей, эмульсий, покрытий и красок.

Можно надеяться, что успехи в создании искусственных клеток в будущем помогут построить надежные биореакторы для дешевого производства сложных химических соединений. Искусственные клетки могут послужить основой для биосенсоров, которые работают в условиях, не совместимых с выживанием обычных клеток, а также будут полезны для создания новых методов лечения и диагностики заболеваний – например, в качестве инструмента для местного синтеза и целевой доставки лекарств.

Источник:
Blanken et al., Genetically controlled membrane synthesis in liposomes // Nature Communications, 2020.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru