Подписаться на новости
  • Сенатор
  • ООО "Ай Вао"
  • TechWeek
  • Биомолтекст2020
  • vsh25

Направленная сборка содержащих клетки микрогелей для создания трехмерных тканевых конструкций

По материалам статьи Yanan Du et al. «Directed assembly of cell-laden microgels for fabrication of 3D tissue constructs»
(PNAS July 15, 2008 vol. 105 no. 28 9522-9527).

Ученые Гарвардского и Кембриджского университетов и Массачусетского технологического института разработали метод управляемой «снизу вверх» сборки нагруженных клетками микрочастиц гидрогеля для создания тканевых конструкций. В основе предлагаемого процесса лежит способность многофазных жидкостных систем минимизировать площадь поверхности фаз и, соответственно, свободную поверхностную энергию раздела фаз. Сложность микроархитектуры таких гидрогелей регулируется изменением внешних воздействий.

Большинство живых тканей состоит из повторяющихся фрагментов, представляющих собой комплексы клеток различных типов, обладающие строго определенной трехмерной микроархитектурой и выполняющие специфичные для данной ткани функции. При создании искусственных тканевых конструкций важнейшую роль для обеспечения выполнения тканеспецифичных функций играет воспроизведение структурных особенностей природной ткани. Однако большинство подходов тканевой инженерии основано на самосборке сложных клеточных структур на биоразрушаемых каркасах (по принципу «сверху вниз». Имитация структуры природных тканей при этом подходе не всегда происходит достаточно корректно. Использование гидрогелей предоставляет новые возможности решения этой проблемы путем создания биосовместимых гидрогелевых структур размером от <1 мкм (внутриклеточный уровень) до >1 см (тканевой уровень).

Привлекательность микрогелей для тканевой инженерии обусловлена их физическими свойствами (строго определенная форма частиц, механическая прочность, биоразрушаемость и др.) и биологическими параметрами (биосовместимость, схожесть с естественным внеклеточным матриксом и способность удерживать клетки в естественных тканевых концентрациях). В настоящее время использование микрогелей в тканевой инженерии ведется согласно двум принципам: «нисходящему» и «восходящему». Нисходящий принцип позволяет контролировать параметры микроструктуры (такие как размер и форма) сравнительно крупных фрагментов гидрогелей, а восходящий – создавать более крупные тканевые конструкции посредством объединения мелких блоков (обычно нагруженных клетками частиц микрогеля).

На сегодняшний день восходящую сборку микрогелей осуществляют с помощью фотолитографии, позволяющей располагать слои микрогеля строго определенным образом, а также путем произвольного слияния содержащих клетки частиц микрогеля или физических манипуляций над отдельными частицами микрогеля. К ограничениям метода произвольной самосборки относится невозможность управления расположением частиц гидрогеля и структурой конечного продукта, а два других подхода многоэтапны, требуют больших временных затрат и непригодны для масштабного производства. Эти трудности обуславливают необходимость поиска восходящего метода, обеспечивающего направленную самосборку необходимого количества материала.

Впервые метод самосборки частиц, размер которых не превышал несколько миллиметров, в четко структурированные двух- и трехмерные объекты посредством минимизации свободной энергии на границе раздела жидких фаз предложен Whitesides et al. Однако их подход не применим к тканевым конструкциям из-за цитотоксичности используемых материалов и жесткости необходимых для такого процесса физических условий.

Авторы рассматриваемой статьи предлагают принципиально новый подход к самосборке содержащих клетки частиц микрогеля в тканевые структуры посредством использования «гидрофобного эффекта» – термодинамической тенденции многофазных жидкостных систем к минимизации поверхности раздела фаз, за счет которого свободная энергия поверхности раздела гидрофобной и водной фаз, пропорциональная площади поверхности раздела, стремится к минимуму.

Для тестирования гидрофобного эффекта авторы с помощью фотолитографии синтезировали частицы полиэтиленгликолевого (ПЭГ) микрогеля, которые помещали в гидрофобную фазу из минерального масла. После этого с помощью управляемого перемешивания осуществляли сборку более крупных структур микрогеля (рис. 1).

В результате исследователи получили структуры четырех типов: линейные, разветвленные, беспорядочные и со смещением фрагментов. Так как гидрофобный эффект минимизирует поверхность раздела водной и масляной фаз (вода разбивается на сферические капли), оптимальным геометрическим решением в рассматриваемом случае является формирование кубических структур, состоящих из плотно упакованных прямоугольных фрагментов гидрогеля. Однако наиболее интересной с практической точки зрения оказалась фракция агрегатов, формирующих линейные сегменты, благодаря небольшой длине цепочек обеспечивающие наиболее приемлемый с термодинамической точки зрения результат.


Рис. 1. Схематическая диаграмма процесса сборки микрогелевых комплексов. Синтезированные с помощью фотолитографии частицы микрогеля вносили в емкость с минеральным маслом и вручную перемешивали кончиком пипетки. В результате получили структуры четырех типов: линейные, разветвленные, беспорядочные и со смещением фрагментов. Вторичную поперечную сшивку фрагментов осуществляли с помощью воздействия ультрафиолетового излучения. (Цена деления масштабной линейки – 200 мкм).

Влияние скорости и продолжительности перемешивания, а также присутствия поверхностно-активного вещества оценивали по характеристикам прямоугольных частиц микрогеля (рис. 2). Более быстрое перемешивание обеспечивало получение большей фракции линейных комплексов (до 30% за 15 сек.) (рис. 2А). Увеличение продолжительности времени перемешивания вызывало асимптотический рост фракции линейных комплексов в течение первых 60 секунд, после чего рост фракции останавливался (рис. 2 B).


Рис. 2. Оптимизация сборки микрогеля. Влияние (А) скорости перемешивания (быстрая, средняя и медленная), (В) продолжительности перемешивания и (С) добавления поверхностно-активного вещества.

Поверхностное натяжение является движущей силой агрегации частиц микрогеля посредством минимизации поверхности их соприкосновения с масляной фазой. Для изучения влияния изменения этого параметра на процесс агрегации авторы меняли поверхностное натяжение границы раздела фаз добавлением эмульгатора (Твин 20). Как и ожидалось, добавление поверхностно-активного вещества значительно снижало движущую силу направленной агрегации частиц микрогеля (рис. 2С), что выражалось в уменьшении фракции линейных и разветвленных комплексов и увеличении фракции неупорядоченных агрегатов по мере повышения концентрации эмульгатора.

Исследователи также проанализировали влияние изменения размеров отдельных частиц микрогеля на формирование комплексов. При постоянной высоте фрагментов (150 мкм) их длину и ширину увеличивали с 200 до 1000 мкм с шагом в 200 мкм. При этом более мелкие частицы обеспечивали получение бОльших фракций линейных и разветвленных комплексов и меньших фракций неупорядоченных структур, чем крупные частицы микрогеля (рис. 3А). Возможно, это обусловлено более высокими гидродинамической силой и силой сопротивления, действующими на более крупные частицы микрогеля и перевешивающими силы, ассоциированные с гидрофобным эффектом. Более того, частицы микрогеля с более высокими показателями соотношения размеров формируют цепи с бОльшим количеством звеньев (рис. 3В), что минимизирует площадь поверхности раздела фаз.


Рис. 3. Влияние размеров частиц микрогеля на их агрегацию. (А) Состав комплексов и (В) средняя длина цепочек линейных, разветвленных и неупорядоченных агрегатов.

Несмотря на то, что двухфазный процесс сборки позволяет управлять формированием комплексов микрогеля, получаемые структуры нестабильны вне масляной фазы. Для стабилизации связей между частицами микрогеля проводили этап вторичного «связывания» – материал в течение 4 секунд подвергали воздействию ультрафиолетового излучения.

Для оценки возможности использования разработанного процесса для нужд тканевой инженерии в частицы микрогеля инкапсулировали фибробласты линии NIH 3T3. Непосредственно после инкапсуляции бОльшая часть клеток сохраняла жизнеспособность. Более того, использование разработанного процесса сборки более крупных конструкций сохраняло жизнеспособность клеток на достаточно высоком уровне (рис.4А). К удивлению авторов, небольшое количество клеток гибло на этапе перемешивания двухфазной системы, что, возможно, вызвали водорастворимые загрязнители, содержащиеся в гидрофобной фазе. Как и ожидалось, продолжительность воздействия ультрафиолета оказывала значительное влияние на жизнеспособность клеток, что указывает на необходимость максимального сокращения обоих этапов.


Рис. 4. Нагруженные клетками частицы микрогеля. (А) Фазово-контрастное и флуоресцентное изображения содержащих клетки (NIH 3T3) комплексов микрогеля после этапов первичного и вторичного связывания соответственно. (В) Жизнеспособность клеток после каждого из этапов формирования агрегатов микрогеля.

Рис. 5. Управляемая сборка фрагментов микрогеля, осуществляемая по принципу «ключ-замок». (А) Флуоресцентные изображения крестообразных частиц микрогеля, окрашенных FITC-декстраном. (B) Вытянутые частицы микрогеля, окрашенные красителем Nile red. (C-H) Фазово-контрастные и флуоресцентные изображения комплексов «ключ-замок» с различными количественными соотношениями крестообразных и вытянутых частиц. (I, J) Флуоресцентные изображения микрогелевого комплекса, состоящего из крестообразных частиц, содержащих меченые красным клетки, и вытянутых частиц, содержащих меченые зеленым клетки. (Цена деления масштабной линейки – 200 мкм).

При применении существовавших ранее методов, несмотря на возможность управления размерами и архитектурой конечных комплексов микрогеля, соединение отдельных частиц происходило случайным образом. Например, невозможно было контролировать смежное расположение частиц разных типов микрогеля. Для демонстрации пригодности нового подхода для создания более сложных структур с заданными свойствами при создании частиц микрогеля авторы использовали так называемый подход «ключ-замок», обеспечивающий взаимное расположение двух типов частиц микрогеля в конечном комплексе. Как видно на рис. 5, частицы микрогеля крестообразной и вытянутой формы (рис. 5 А, В) можно направленно объединять таким образом, что одна крестообразная частица соединяется с одной, двумя и тремя вытянутыми частицами (рис. 5 С-Н). Предлагаемый метод без какой-либо дополнительной оптимизации позволяет получать до 10% комплексов «ключ-замок». Кроме того, авторы продемонстрировали пригодность такого подхода для создания комбинированных культур клеток. Для этого они инкапсулировали клетки, меченые красными и зелеными метками, в крестообразные и вытянутые частицы микрогеля и создавали миниатюрные тканевые конструкции из клеток двух типов (рис. 5 I, J).

Таким образом, авторы разработали метод, использующий термодинамические свойства многофазных жидкостных систем для сборки нагруженных клетками микрочастиц гидрогеля.

Они продемонстрировали возможность управления сборкой частиц гидрогеля с помощью сил, вовлеченных в минимизацию свободной поверхностной энергии раздела фаз. Этот восходящий метод направленной сборки содержащих клетки частиц микрогеля является эффективным подходом к созданию трехмерных тканевых конструкций, производительность которого достаточно легко регулировать. Учитывая растущие возможности фотолитографических подходов, авторы считают, что новый метод позволит создавать высокоструктурированные комплексы, производство которых с помощью традиционных систем микроинженерии слишком затруднительно и требует больших затрат времени.

Евгения Рябцева
Портал «Вечная молодость» http://www.vechnayamolodost.ru

06.10.2008

Читать статьи по темам:

тканевая инженерия Версия для печати
Ошибка в тексте?
Выдели ее и нажми ctrl + enter
назад

Читать также:

Журнал «Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия» доступен в электронном виде

Все номера научно-информационного, аналитического журнала «Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия» теперь абсолютно бесплатно доступны в электронном виде всем желающим.

читать

Нанотрубки для упрочнения искусственной кости

Использование каркасов из пористого материала, пронизанных углеродными нанотрубками, позволяет выращивать костную ткань повышенной плотности.

читать

Для изготовления искусственных хрящей необходимо высокое давление

При выращивании в периодически включаемом гидравлическом прессе искусственная хрящевая ткань вырастает в три раза более прочной, чем при нормальном давлении.

читать

Нанопленка для регенерации хряща

В результате подбора оптимальной формы поверхности и параметров электростимуляции скорость формирования ткани хряща на основе из новой нанопленки удалось увеличить более чем в три раза.

читать

Один американец засунул в пудру палец…

Для пущей убедительности большинство публикаций на тему «Как американец отрастил отрезанный палец» снабжены фотографиями пострадавшего пальца «до» (слабонервным не смотреть!) и «после».

читать