Новый внутриклеточный биосенсор
РНК-сенсор начали использовать для оценки экспрессии генов в живой клетке
Американские биоинженеры создали и испытали внутриклеточный сенсор экспрессии гена, основанный на системе редактирования двухцепочечной РНК. Конструкция позволяет обнаруживать искомую РНК в цитоплазме живой клетки, не прибегая к геномному редактированию и не нарушая экспрессию гена. Эту технологию, названную CellREADR, можно после несложных модификаций приспособить под оптогенетические эксперименты и кальциевую визуализацию. Исследование опубликовано в Nature (Qian et al., Programmable RNA sensing for cell monitoring and manipulation).
Изучение реакции клеток на лекарства и исследование развития мозга часто требует понимания того, как меняется транскрипция отдельных клеток. Современные транскриптомные технологии позволяют анализировать экспрессию генов в единичных клетках (и иногда даже не убивая клетку), но касаются в основном исследований ex vivo.
Для ситуаций, когда надо оценить изменение экспрессии гена в живом организме, существуют генетические линии, в которых репортерный ген регулируют те же последовательности, что и «ген интереса». Но далеко не для каждого белка и не для каждого модельного объекта есть генетическая линия со встроенным в геном сенсором экспрессии. Создание моделей зачастую долго и сложно, а даже современные технологии геномного редактирования не лишены ошибок.
Биоинженеры и нейробиологи из Университета Дьюка и Лаборатории Колд-Спринг-Харбор под руководством Джоша Хуана (Josh Huang) разработали РНК-сенсор экспрессии гена. В основе технологии CellREADR (Cell access through RNA sensing by Endogenous ADAR) лежит внутриклеточная система посттранскрипционной модификации РНК на базе ферментов РНК-специфических аденозиндезаминаз (ADAR). Эти ферменты, которые есть в большинстве клеток животных, «ищут» некомплементарные пары азотистых оснований «аденин-цитозин» в двухцепочечных РНК в цитоплазме. При обнаружении такой пары ADAR запускает цепь реакций, в результате которых аденин заменяется на гуанин.
Предложенная одноцепочечная молекула РНК (авторы назвали ее readr-РНК) функционально состоит из двух частей. Сенсорный сегмент длиной 200-350 нуклеотидов, на 95-98 процентов комплементарен искомой РНК. Он начинается с последовательности, запускающей трансляцию, а заканчивается стоп-кодоном, частично комплементарным по отношению к искомой мРНК.
Если такая РНК попадает в клетку, в которой нет РНК-мишени, то с нее транслируется нефункциональный белок, и на стоп-кодоне все заканчивается. Но если сенсор связывается с мишенью, то ADAR обнаруживают нарушение комплементарности в стоп-кодоне readr-РНК. После активации ADAR стоп-кодон меняется на кодирующий, и происходит трансляция белка, закодированного во второй половине РНК. В ней закодирован белок T2A, способный к аутопротеолизу, и репортерный белок (флуоресцентный, хемо-, фотосенсор или даже индуктор апоптоза). Синтезированную РНК можно «упаковать» в вирус или в липосому.
Разработав концепцию, доктор Хуан с коллегами протестировали методику на культуре клеток человека. Эксперимент показал, что ложное срабатывание возникает в 0,3-0,5 процентах клеток культуры, а чувствительность колеблется в диапазоне 10-50 процентов, в зависимости от экспрессии гена. Эксперименты с изменением сенсорной последовательности показали, что в одной readr-РНК можно соединить два сенсора к двум разным мишеням.
Отработав технологию на клеточных культурах, исследователи протестировали ее на многоклеточных организмах. Они нацеливали readr-РНК на белки, специфичные для разных чувствительных и двигательных субпопуляций нейронов коры полушарий мозга мышей, крыс и людей (в последнем случае ученые использовали живые биоптаты мозговой ткани). Специфичность колебалась в пределах 62-92 процента в зависимости от белка-мишени и популяции нейронов. Если использовать сигнальную последовательность к двум разным РНК, то специфичность вырастала до 85-97 процентов.
Специфичность CellREADR при выявлении пирамидных нейронов двигательной коры. Рисунки из статьи Qian et al.
Но можно использовать CellREADR не только для мониторинга активности, но и для манипуляции ею. В одном из экспериментов доктор Хуан с коллегами добавили РНК каналородопсина (белка, обеспечивающего реакцию на свет у одноклеточных водорослей) в репортерную часть readr-РНК, нацеленной на «двигательные» пирамидные нейроны коры мышей. Оптогенетическая стимуляция мозга животного вызывала движение лапы. Скорость и амплитуда этого движения были такими же, как и при «обычной» оптогенетике, когда ген родопсина интегрирован в геном.
РНК-сенсор можно использовать и для оптогенетических исследований. Мышь шевелит лапой в ответ на фотостимуляцию коры.
Эксперимент с соматосенсорной корой и кальцийзависимым белком GCaMP6 показал, что READR можно использовать и для кальциевой визуализации активности нейронов. Исследование безопасности readr-РНК показало, что уровень нейровоспаления спустя три месяца после трансфекции не изменился, как и экспрессия целевых генов.
На основании проведенных экспериментов авторы заключают, что методика достаточно универсальна и легко поддается настройке под разные задачи. Новый метод работает in vivo, не зависит от трансляции и от роли конечного белкового продукта. Его можно настроить на разные этапы посттранскрипционной модификации РНК, что бывает важно при оценке экспрессии дифференциально сплайсируемых белков.
Впрочем, есть у метода и недостатки: судя по представленным результатам, одновременно можно ценить активность лишь нескольких генов, а чувствительность к экспрессии некоторых из них едва дотягивает до 10 процентов. Эксперименты на более долгоживущих животных, чем мыши, позволят сказать, насколько долго живет readr-РНК в клетках, и есть ли будущее у CellREADR в оценке результатов клеточной и геномной терапии заболеваний человека.
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru