РНК-интерференция: усовершенствован метод обратимого выключения генов
LifeSciencesToday по материалам Cold Spring Harbor Laboratory:
CSHL team perfects non-lethal way of switching off essential genes in mice
Одним из способов изучения функции гена является его выключение и наблюдение за тем, какое влияние потеря его активности оказывает на организм. Однако, если ген важен для выживания, постоянное его отключение убьет организм прежде, чем будет определена его функция. Ученые Лаборатории Колд Спринг Харбор (CSHL) преодолели это препятствие с помощью технологии РНК-интерференции (RNA interference, RNAi). Они научились временно выключать какой-либо важный ген у взрослых мышей, а затем снова включать его, прежде чем это изменение убьет животных.
В статье Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference, опубликованной в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences, исследователи описывают возможности этого подхода на примере выключения гена, необходимого для репликации ДНК. Ген оставался отключенным до тех пор, пока мыши не начинали терять вес и не оказывались на грани смерти. Включение гена успешно обращало эти симптомы вспять и спасало животных.
Возможность регулировать активность генов этим способом у животных «не только поможет в выявлении периода, в течение которого жизненно необходимые гены важны на стадии развития, но и будет чрезвычайно полезна в исследованиях рака и других заболеваний», уверен научный сотрудник Медицинского института Говарда Хьюза (Howard Hughes Medical Institute, HHMI) профессор CSHL Скотт Лоу (Scott Lowe). «Используя мышей, мы могли бы, например, сначала позволить опухолям расти, а затем выключить ген. Мы считаем, это могло бы быть хорошей терапевтической мишенью для проверки того, спасет ли это животных».
Для подавления активности генов с помощью РНК-интерференции ученые используют молекулы коротких шпилечных РНК (short hairpin-shaped RNAs, shRNAs), связывающиеся с соответствующими участками РНК гена-мишени и вызывающие его разрушение. Это позволяет подавить синтез белка, кодируемого данным геном. Уточнив и оптимизировав за последние несколько лет процесс использования таких shRNAs для подавления активности генов у мышей, Лоу и его коллеги выступили с технологической платформой, недавно опубликованной в журнале Cell, которая позволила им создавать генетически модифицированных, или трансгенных, мышей в пределах 4 месяцев, что в три раза быстрее, чем с использованием стандартных подходов (A Rapid and Scalable System for Studying Gene Function in Mice Using Conditional RNA Interference).
Настоящее исследование имело целью проверить, является ли новая оптимизированная система достаточно надежной, чтобы обеспечить эффективный таргетинг важнейших генов. Чтобы найти полностью подходящий для исследования ген-мишень, ученые сначала провели скрининг «библиотеки» RNAi, или большой коллекции коротких шпилечных РНК. Им нужно было выбрать только те молекулы, которые блокируют пролиферацию путем подавления конкретного гена. Скрининг выявил shRNAs против одной части – субъединицы 3 – белка репликации А (replication protein A, RPA3), белкового комплекса, открытого в лаборатории соруководителя исследования президента CSHL профессора Брюса Стиллмана (Bruce Stillman) в 1980-х годах. Белок репликации А способствует репликации ДНК путем стабилизации раскручивания ее цепочек и рекрутирования других необходимых белков.
Ученые связали молекулы shRNAs, мишенью которых является RPA3, с флуоресцентным белком. Затем эти молекулы были использованы для создания трансгенных мышей. У таких мышей получение с пищей определенного препарата, например, тетрациклина, провоцирует РНК-интерференцию и выключение гена RPA3. Флуоресцентные метки позволяли легко отслеживать ткани, в которых ген-мишень RPA3 был выключен.
Когда ученые индуцировали подавление PRA3 у взрослых мышей, у животных быстро атрофировалась ткань кишечника, в результате чего они теряли вес и умирали в течение 8-11 дней. Но если препарат снимали, когда мыши были почти на грани смерти, атрофия ткани и потеря веса полностью отменялись, и животные выживали.
В отличие от клеток ткани кишечника нормальных мышей (вверху)
клетки мышей с выключенным короткими шпилечными РНК геном белкового комплекса PRA3
не пролиферируют, что приводит к атрофии ткани (внизу).
Фото: Scott Lowe
Лоу, Стиллман и их коллеги планируют продолжить изучение таких мышей, чтобы понять механизмы сохранения и регенерации тканей. Однако они очень рады возможности и более широкого использования разработанного ими подхода.
«Возможность переключения активности генов на любом этапе – большой шаг вперед по сравнению с другими методами выключения генов, которые не являются обратимыми», – говорит профессор Стиллман. «Этот подход на животных моделях – ближайший генетический эквивалент лечения пациентов с помощью одной единственной дозы основанного на малых молекулах препарата, мишенью которого является конкретный ген. Значение этой системы для тестирования новых терапевтических мишеней и оценки их эффективности и побочных эффектов невозможно переоценить».
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru
21.04.2011