Что там, внутри клетки?
Исследователи Гарвардского университета, работающие под руководством профессора Пэна Иня (Peng Yin), разработали новый метод микроскопии, позволяющий получать изображения, на которых одновременно представлены десятки различных биомолекул, входящих в состав одной клетки. Такие изображения помогут разобраться в сложных внутриклеточных механизмах и могут быть использованы в разработке новых методов диагностики заболеваний и прогнозирования и течения, а также мониторинга эффективности терапии на клеточно-молекулярном уровне.
В выполнении сложных клеточных функций часто задействованы десятки и даже сотни различных белков и молекул РНК. Современные методы, как правило, позволяют одновременно визуализировать максимум три или четыре типа молекул. Однако для полного понимания клеточных функций исключительно важно визуализировать всех или, по крайней мере, большинство участников процесса, так как, рассматривая одновременно только по несколько компонентов, невозможно оценить полную картину происходящего.
Для выполнения этой задачи группе Иня предстояло преодолеть законы физики, в течение столетия затруднявшие работу микроскопистов. Проблема заключается в том, что если расстояние между двумя объектами составляет меньше 200 нанометров (так называемый дифракционный предел, соответствующий примерно 1/5 толщины человеческого волоса), их невозможно отличить друг от друга с помощью традиционного светового микроскопа. Вместо двух объектов смотрящий в окуляр человек видит лишь одно размывчатое пятно.
С середины 1990-х в распоряжении ученых стали появляться новые методы, позволяющие преодолеть этот барьер с помощью комбинирования специализированных оптических систем и особых флуоресцентных белков или красителей, метящих клеточные компоненты.
Один из таких методов, получивший название DNA-PAINT, был разработан доктором Ральфом Юнгманом (Ralf Jungmann) из лаборатории профессора Иня в процессе выполнения диссертационного проекта. DNA-PAINT позволяет получать очень четкие изображения трех молекул одновременно за счет мечения их различными красителями.
Чтобы получить более детализованные изображения происходящих в клетке процессов, исследователи модифицировали DNA-PAINT, в результате чего появился новый метод визуализации, названный Exchange-PAINT.
В основе нового метода лежит способность цепочек ДНК специфично связываться с комплементарными цепочками ДНК. Исследователи метят молекулу-мишень короткой цепочкой ДНК, после чего добавляют в раствор комплементарную цепочку, меченую флуоресцентным красителем, начинающим светиться только при соединении двух цепочек. Две цепочки соединяются на короткий период времени, продолжительность которого с точностью регулируется исследователями. Генерируемый в результате всплеск свечения позволяет получать ультрарезкое изображение.
Повторение этого процесса обеспечивает визуализацию второй, третьей и последующих молекул-мишеней. При наложении полученных изображений получается композиционная картина, на которой каждая молекула-мишень окрашена своим цветом. Это позволяет создавать изображения, компоненты которых окрашены дополнительными искусственными цветами, благодаря чему возможности визуализации выходят далеко за пределы, ограничиваемые количеством существующих флуоресцентных красителей. А полученные в конечном итоге изображения в мельчайших деталях отражают изучаемый молекулярный процесс.
Для тестирования Exchange-PAINT исследователи синтезировали 10 уникальных последовательностей ДНК – так называемых ДНК-оригами, – изображающих цифры от 0 до 9. При использовании нового метода визуализации эти цифры были различимы на расстоянии меньше 10 нанометров, что соответствует 1/12 дифракционного предела. Также им удалось получить четкие изображения всех 10 ДНК-оригами на одной картинке.
10-цветные ультрачеткие изображения (искусственным образом составленные в одну композицию) искусственных ДНК-наноструктур, имеющих форму цифр от 0 до 9, полученные с помощью метода Exchange-PAINT с использованием только одного красителя и однолучевого лазера. Фото: Johannes B. Woehrstein/Wyss Institute
Более того, авторы использовали метод Exchange-PAINT для получения детализованных ультрарезких изображений фиксированных человеческих клеток, на которых важные клеточные компоненты – микротрубочки, митохондрии, аппарат Гольджи и пероксисомы – были окрашены разными цветами.
На этом ультрарезком изображении, полученном с помощью метода Exchange-PAINT, одновременно видны микротрубочки (зеленый), митохондрии (фиолетовый), аппарат Гольджи (красный) и пероксисомы (желтый) одной человеческой клетки. Фото: Maier Avendano/Wyss Institute
Разработчики считают, что дальнейшее усовершенствование метода Exchange-PAINT позволит использовать его для одновременной визуализации десятков клеточных компонентов. Это предоставит биологам новый мощный инструмент для комплексного изучения протекающих в клетке процессов.
Статья Ralf Jungmann et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT опубликована в журнале Nature Methods.
Евгения Рябцева
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru по материалам Harvard University:
Capturing ultrasharp images of multiple cell components at once.
10.02.2014