Всего один ген – и целая куча болезней
Белок XPD является компонентом механизма, необходимого для восстановления повреждений ДНК. Уникальность XPD заключается в том, что мутации в разных участках его гена лежат в основе трех заболеваний человека: пигментной ксеродермы, характеризующейся повышенной чувствительностью кожи к свету и приводящей к развитию рака; синдрома Коккейна, сочетающего нарушение роста, пигментный ретинит, атрофию зрительных нервов, глухоту, умственную отсталость и преждевременное старение; и трихотиодистрофии (врождённого ихтиоза) – одной из форм преждевременного старения, характеризующейся ломкими волосами и чешуйчатой кожей.
Ученые входящей в структуру министерства энергетики США Национальной лаборатории Лоренса Беркли и исследовательского института Скриппса, работающие под руководством профессора Джона Тейнера (John Tainer), первые расшифровали структуру белка XPD. Полученные данные объясняют, каким образом нарушения структуры этого белка, даже такие незначительные, как изменение двух соседних аминокислотных остатков, могут приводить к развитию заболеваний с различными симптомами, и предоставляет новую информацию о процессах старения и развития рака.
Белок XPD является частью молекулярного комплекса TFIIH, ответственного за восстановление нуклеотидов, по той или иной причине выпавших из последовательности ДНК. TFIIH участвует также в нормальной транскрипции генов и восстановлении ассоциированных с ней повреждений. Подобный ремонт требует устранения и замещения фрагмента цепочки ДНК, содержащего одно или более поврежденных нуклеотидных оснований, распознаваемого по нарушениям в спиральной структуре.
TFIIH соединяется с местом повреждения, и входящие в его структуру ферменты хеликазы, одним из которых является XPD, раскручивают фрагмент длиной в 30 нуклеотидов, содержащий повреждение. После этого в процесс вступает еще целый комплекс ферментов: нуклеазы XPG и XPF вырезают повреждение, полимераза восстанавливает правильную последовательность в соответствии с комплементарной цепочкой, а в завершение лигаза соединяет концы восстановленной цепочки.
Несмотря на то, что белок XPD есть не во всех организмах (бактерии используют другой механизм для восстановления сходных повреждений), структура кодирующего его гена, как и других генов, ответственных за базовые функции живых организмов, сходна у многих видов, от человека и до прокариотов семейства архей (Archaea), часто обитающих в экстремальных условиях, например, в горячих источниках. Последовательность этого гена известна давно, однако структуру белка долго не удавалось расшифровать из-за сложности его очистки и кристаллизации, необходимой для проведения рентгеновской кристаллографии.
Сначала авторы попытались работать с человеческим вариантом XPD, однако оказалось, что он очень плохо растворяется в воде и непригоден для кристаллизации. В поисках гомологичного белка ученые традиционно обратились к обитающим в горячих источниках термофильным организмам, белки которых обычно наиболее стабильны.
Относящийся к семейству архей Sulfolobus acidocaldarius обитает при температуре 80 градусов Цельсия и рН=3, что соответствует жизни в емкости с горячей кислотой. Принадлежащий этому организму вариант белка XPD действительно стабилен и, несмотря на отсутствие в его структуре характерных для человеческого белка выступающих структур, его каталитическое ядро весьма сходно с ядром человеческого фермента. Кроме того, 22 из 26 фрагментов последовательности человеческого гена XPD, в которых возникают ассоциированные с заболеваниями мутации, обнаружены в соответствующем гене S.acidocaldarius.
Уникальной особенностью структуры XPD и ряда других хеликаз является группа атомов железа и серы, легко вступающая во взаимодействие с кислородом. Для предотвращения окисления этой группы очищенный белок необходимо кристаллизовать в анаэробной камере. О неизмененном состоянии железо-серной группы свидетельствует коричнево-красный цвет, выращиваемых кристаллов белка.
Для проведения рентгеновской кристаллографии использовали две формы белка: нативную конформацию и вариант, в котором все остатки аминокислоты метионина были замещены остатками селенометионина. Тяжелые атомы селена хорошо видны в луче синхротрона и позволяют с высокой точность определить положение остатков метионина в аминокислотной последовательности.
Из четырех доменов молекулы белка две, HD1 и HD2, являются типично хеликазными последовательностями, одна представляет собой железо-серный домен 4FeS, выступающая форма которого свидетельствует о его участии в регистрации повреждения и раскрытии спирали ДНК. Четвертый домен – Arch – оказался полной неожиданностью. Совместно с 4FeS Arch формирует в глобуле XPD необычный свод над тоннелеподобным отверстием в конце длинного желоба. Электрический заряд выстилающих желоб аминокислот и рельеф структуры свидетельствует о том, что она является коридором для связывания и перемещения ДНК.
На рисунке изображены четыре домена XPD: хеликазы HD1 (зеленый) и HD2 (голубой), железо-серный комплекс 4FeS (коричнево-красный) и Arch (фиолетовый). Места мутаций, вызывающих пигментную ксеродерму, отмечены красным; пигментную ксеродерму в комплексе с синдромом Коккейна – золотым, а трихотиодистрофию – фиолетовым.
После выяснения структуры молекулы белка авторы протестировали в лабораторных условиях следующие его функции: способность гидролизовать АТФ – АТФазную активность, способность раскручивать цепочку ДНК – хеликазную активность и способность связывать ДНК.
Исследователи оценили функции 15 мутантных форм XPD, содержащих специфичные мутации, ассоциированные с пигментной ксеродермой, синдромом Коккейна и трихотиодистрофией. Все три заболевания повышают чувствительность кожи к ультрафиолету солнечного света – основной причине нуклеотидных повреждений, устраняемых комплексом TFIIH. Однако пигментная ксеродерма в тысячи раз повышает риск развития рака кожи, а два других заболевания не влияют на этот показатель, но приводят к различным формам преждевременного старения.
Эффекты отдельных мутаций очень трудно предсказать без знания молекулярной структуры белка. В случае XPD для ученых оставалось загадкой, каким образом очень сходные мутации (в одном из случаев – изменение той или другой из двух расположенных рядом аминокислот) могут вызывать разные заболевания.
По словам авторов, только имея представление о структуре молекулы белка, можно понять, каким образом мутации соседних аминокислот могут оказывать различные эффекты: одна изменяет свойства ДНК-связывающего канала, а другая – движение доменов относительно друг друга. В одном случае у человека развивается пигментная ксеродерма, а в другом – синдром Коккейна.
Вызывающие пигментную ксеродерму мутации непосредственно влияют на связывающие ДНК и АТФ каналы внутри молекулы XPD. Эти изменения снижают эффективность раскручивания ДНК мутантными формами белка.
Мутации другого типа, вызывающие синдром Коккейна в комбинации с пигментной ксеродермой, нарушают подвижность хеликазных доменов, которые должны изменять конформацию молекулы в процессе восстановления повреждений ДНК.
К трихотиодистрофии приводят мутации, которые могут как снижать, так и не снижать активность хеликазы, но неизменно нарушают стабильность всей структуры. Некоторые мутации домена 4FeS настолько сильно нарушают структуру белка, что полностью подавляют хеликазную активность.
Расшифровка структуры каталитического ядра XPD является значимым достижением в понимании механизмов транскрипции и обеспечиваемого TFIIH восстановления повреждений ДНК и предоставляет информацию о том, каким образом различные нарушения этих механизмов вызывают признаки физического старения и ведут к формированию рака. Однако ученым необходимо узнать об этом исключительно важном белке еще очень много.
Евгения Рябцева
Портал «Вечная молодость» www.vechnayamolodost.ru по материалам ScienceDaily
05.06.2008