Идентифицирован ген, вовлеченный в развитие ишемической болезни сердца
Юлия Панченко, PCR.news
Ишемическая болезнь сердца (коронарная недостаточность) остается основной причиной смертности в мире. Однако мы не до конца понимаем атеросклероз, патофизиологический процесс, участвующий в развитии и прогрессировании ишемической болезни сердца. Атеросклероз вызывают многие внешние и внутренние факторы. В результате нарушается гомеостаз стенок сосуда из-за накопления липопротеинов и воспаления. Ранее GWAS выявил более 250 локусов, ассоциированных с ишемической болезнью сердца. Авторы предположили, что некоторые варианты напрямую модулируют функции эндотелиальных клеток. В новой работе они использовали скрининг с помощью системы CRISPR для проверки роли вариантов, ассоциированных с ишемической болезнью сердца, в работе эндотелиальных клеток сосудов.
Исследователи выбрали 92 варианта, выявленные с помощью GWAS, в 89 локусах, ассоциированных с ишемической болезнью сердца, а также варианты, находящиеся в неравновесном сцеплении с ними, всего 2893 варианта. После контроля качества авторы сконструировали 7393 гидРНК, таргетирующие 1998 вариантов в 83 локусах.
В экспериментах использовались иммортализированные человеческие эндотелиальные клетки аорты (teloHAEC), а также конструкции для внесения двухцепочечных разрывов (Cas9), ингибирования (dCas9-KRAB, CRISPRi) и активации (dCas9-VP64, CRISPRa). Пулированные CRISPR-библиотеки доставляли с помощью лентивирусов в клетки, стабильно экспрессирующие Cas9, CRISPRi или CRISPRa. Клетки обрабатывали TNFα , чтобы найти гены, которые могут блокировать или индуцировать воспалительный ответ. Также клетки метили флуоресцентными антителами против E-селектина, VCAM1 или ICAM1 или флуоресцентными красителями метили сигнальные молекулы ROS, NO, Ca2+, после чего сортировали клетки на проточном цитометре. У сортированных клеток амплифицировали и секвенировали гидРНК, чтобы идентифицировать те из них, что значительно влияют на функции эндотелиальных клеток.
Чтобы проверить, работает ли выбранный авторами подход, они добавили в библиотеку 330 гидРНК против кодирующих последовательностей генов, важных для выживаемости клетки. Для Cas9 и CRISPRi снизилось число гидРНК, таргетирующих жизненно важные гены, после сортировки. Также использовались и другие контроли.
Всего исследователи выявили 51 значимую пару вариант-результат, включая 42 варианта, расположенных в 25 локусах, ассоциированных с ишемической болезнью сердца. Из этих вариантов 30 расположены в интронах, пять — в межгенных областях, четыре — в экзонах и три — в промоторах.
После этого авторы валидировали полученные результаты, для чего использовали индивидуальные гидРНК. Так, для гена MAT2A было показано, что, таргетируя Cas9 к синонимичному варианту rs1078004, можно повысить выработку ROS в клетках, обработанных TNFα. MAT2A кодирует метионинаденозилтрансферазу, отвечающую за биосинтез S-аденозилметионина, прекурсора антиоксиданта глутатиона.
Также авторы обратили внимание на вариант rs12906125 в локусе FURIN/FES, который уже ранее связывали с ишемической болезнью сердца при изучении транскриптома и эпигенома эндотелиальных клеток человека. Причем дальнейший анализ показал, что с этой болезнью могут быть связаны как FURIN, так и FES. Для определения функции FES в развитии атеросклероза нужны дополнительные исследования.
Две валидированные гидРНК таргетируют экзонные варианты rs207462 и rs2240243 гена DHX38. Он кодирует РНК-хеликазу, вовлеченную в сплайсинг. На основе наблюдаемых результатов авторы предположили, что эндотелиальные клетки с инделами в гене DHX38 подвергаются преждевременному старению, а также вызывают старение в окружающих клетках.
В конце авторы проанализировали результаты секвенирования РНК единичных клеток человеческих коронарных артерий. Они показали, что эндотелиальные клетки экспрессируют DHX38, MAT2A, CCDC92, FES и FURIN, а значит, их роль в атеросклерозе нужно изучать дальше.
Источник: Florian Wünnemann, et al. Multimodal CRISPR perturbations of GWAS loci associated with coronary artery disease in vascular endothelial cells // PLoS Genetics
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru