РНК-мишени для CRISPR
Инструмент для редактирования ДНК CRISPR произвел настоящую революцию в генетике. Он помог ученым определить гены, которые играют ключевую роль в развитии различных патологических состояний (серповидноклеточная анемия, метастазирование рака легких и другие). Метод ограничен тем, что способен редактировать только ДНК. Но для многих участков человеческого генома нацеливание на ДНК может быть неэффективным, а некоторые другие организмы, в частности РНК-вирусы (коронавирус, вирус гриппа и проч.), вообще не могут быть изменены.
Исследователи из лаборатории Невилла Санджана в Нью-Йоркском геномном центре и Нью-Йоркском университете, используя фермент Cas13, разработали оптимизированную платформу для массивных параллельных генетических скрининговых тестов на уровне РНК в клетках человека. Эта технология скрининга может быть использована для понимания многих аспектов регуляции РНК и для определения функции некодирующих РНК.
Ориентируясь на тысячи различных сайтов в транскриптах РНК человека, исследователи разработали прогностическую модель, основанную на машинном обучении, чтобы ускорить идентификацию наиболее эффективных направляющих РНК. Новая технология доступна для исследователей на веб-сайте и в наборе инструментов с открытым исходным кодом для прогнозирования эффективности РНК для пользовательских мишеней РНК. Она предоставляет предварительно разработанные направляющие РНК для всех генов, кодирующих белки человека.
Авторы намерены провести глубокий систематический анализ, чтобы разработать ключевые принципы моделирования для наиболее эффективного применения скрининга РНК на основе CRISPR.
Cas13 представляют собой ферменты CRISPR типа VI, которые недавно были идентифицированы как программируемые РНК-управляемые и РНК-нацеленные белки с нуклеазной активностью, которая позволяет произвести нокдаун гена-мишени без изменения генома. Это свойство делает Cas13 потенциально значимым терапевтическим средством для воздействия на экспрессию генов без постоянного изменения последовательности генома.
Исследователи также разработали набор новых инструментов на основе Cas13 и провели скрининг транскриптов и перестановок в клетках млекопитающих. В общей сложности они собрали информацию о более чем 24 000 мишенях для редактирования РНК.
В ходе этой сложной работы были обнаружены некоторые интересные биологические идеи, которые могут расширить применение РНК-нацеленных ферментов Cas13. Например, в выводах группы есть информация о том, какие области направляющей РНК более важны для распознавания целевой РНК. Используя тысячи направляющих РНК с одним, двумя или тремя однобуквенными несоответствиями к своей целевой РНК, они идентифицировали критическую «начальную» область, которая чувствительна к несоответствиям между CRISPR и целью. Это открытие поможет ученым избежать нецелевой активности при редактировании РНК. Поскольку типичная человеческая клетка экспрессирует приблизительно 100 000 РНК, точный поиск Cas13 только намеченной мишени имеет жизненно важное значение для скрининга и терапевтического применения. В дополнение к пониманию нецелевого действия Cas13, полученная информация может лечь в основу биосенсоров нового поколения, которые смогут более точно различать тесно связанные виды РНК.
Использование оптимизированной системы скрининга Cas13 для выявления некодирующих РНК значительно расширит набор инструментов CRISPR для прямого генетического и транскриптомного скрининга. Исследователи обнаружили разницу в нокдауне белков при нацеливании на разные кодирующие и некодирующие элементы матричных РНК и нашли доказательства того, что Cas13 конкурирует с другими РНК-связывающими белками, участвующими в процессинге и сплайсинге транскрипта.
Статья H-H.Wessels et al. Massively parallel Cas13 screens reveal principles for guide RNA design опубликована в журнале Nature Biotechnology.
Аминат Аджиева, портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru по материалам New York Genome Center: New genetic screening platform using CRISPR technology for targeting thousands of genes in a massively-parallel fashion.