Что такое геномные ножницы
Почему CRISPR/Cas9 называют граалем современной медицины?
Один из самых перспективных методов лечения рака и других страшных заболеваний – редактирование генома. Технология эта называется CRISPR/Cas9. В чем её суть, рассказывает Константин Северинов, специалист по регуляция транскрипции генов бактерий, профессор Сколковского института науки и технологий, профессор Ратгерского университета (Нью-Джерси, США), заведующий лабораториями в Институте молекулярной генетики РАН и Институте биологии гена РАН.
Я бы хотел бы рассказать про систему бактериальной иммунности, которая называется CRISPR-Cas и кроме такого небольшого фундаментального введения о том, что это такое, для чего это нужно в природе, рассказать для чего бы это могло быть нужно нам, людям, какие этому есть медицинские применения, биотехнологические применения, экологические, какие угодно.
В качестве введения мы должны себе представить, что планета наша является планетой бактерий, а вовсе не людей. Здесь я так условно очень нарисовал бактериальную клетку, которая живет, делится и, в общем-то, бактерии заполонили собой всю землю, а вовсе не люди. Более того, бактерии заполонили, в частности, людей, поэтому внутри нас с вами находится большее количество клеток бактерий, чем собственно наших с вами клеток.
Но считать, что бактерии тем самым правят миром, было бы неверно, потому что на самом-то деле у бактерий есть огромное количество вирусов и количество этих вирусов, которые паразитируют на бактерии, оно абсолютно чудовищно, то есть кто-то посчитал, что на Земле существует 10 в 31 степени вирусных частиц. Это какое-то совершенно феноменальное количество, ну просто очень много. И вирусы на протяжении миллиардов лет, в течение которых существует жизнь, занимаются тем, что убивают бактерии и делают это очень эффективно.
Вот здесь я рисую такую вирусную частичку очень схематично, она похожа на шприц. Внутри этой вирусной частицы, вот в этой головке находится вирусная ДНК, дезоксирибонуклеиновая кислота, гены. У вирусов есть гены и происходит вот что.
После того, как вирусная частица узнаёт клетку, она узнаёт её по принципу ключ-замок (да, каждый вирус может узнать свою, соответствующую ему клетку), то вирусная ДНК оказывается «впрыснута» внутрь клетки, а затем эта ДНК начинает размножаться, и становится всё больше, больше и больше, клетка заражена. Это немножко похоже на то, что происходит у нас, когда мы болеем гриппом.
При этом с гены, которые находятся на вирусной ДНК, синтезируются в специальные белки, вирусные, в частности необходимые для того, чтобы создать пока что еще пустые вирусные частицы, а затем происходит упаковка вирусной ДНК вирусная частица и вдруг, буквально через 10 минут, клетка бактериальная лопнула, всё её содержимое вытекло, но наружу вышли также и дочерние вирусные частицы, которые совершенно идентичны тому вирусу, который заразил клетку, просто их количество резко увеличилось.
В результате через 15-20 минут после первичного узнавания бактериальной клетки хозяина вирусной частицей, бактериальная клетка лопается, наружу выходит на самом деле около ста вирусных частиц новых, которые способны повторить весь вот этот цикл, да. И так это происходит постоянно.
И надо себе представить, что если бы такой процесс действительно происходил всё время, то очень скоро бактерий бы на свете не было, потому что бактерии не успевают делиться с такой скоростью, чтобы компенсировать их гибель в результате развития вирусов, вирусов становится всё больше и больше.
Очевидно, что этого не происходит и возникает вопрос: почему? Почему бактерии существуют? Это же интересный вопрос. Не обязательно плохие бактерии, есть же и хорошие бактерии.
На каждую бактериальную клетку в природе, ну опять же эти оценки все очень приблизительные, приходится около 10 вирусов. Поэтому в принципе все бактерии должны умереть, а дальше вирусы должны тоже умереть, потому что они становятся живыми лишь постольку поскольку есть клетка, в которой они существуют. В свободной внешней среде они, в общем-то, не очень долговечны.
Казалось бы, всё должно было бы прекратиться, и игра бы закончилась, но она, конечно, продолжается и будет продолжаться еще долго после того, как мы с вами исчезнем с лица планеты.
Ответ на вопрос, почему бактерии существуют, заключается вот в чем, что у них есть защитные системы. Они же тоже не дураки. У них есть защитные системы. Им, конечно, не Господь Бог это дал, просто в ходе эволюции они это приобрели. Специальное устройство, гаджеты, дивайсы, назовите как угодно, которые позволяют им бороться с вирусами. Те бактерии, у которых таких устройств нет, они действительно погибли и поэтому больше мы их не видим. Такая типичная дарвиновская эволюция.
Одной из таких защитных систем является вот эта самая CRISPR-Cas, это просто одна из защитных систем, с помощью которой бактерии борются с вирусами. Открыли эту систему буквально лет там 15 назад. Как она устроена? Давайте мы нарисуем опять бактериальную клетку, она у нас теперь будет побольше, потому что мы будем смотреть внутрь её, нам нужно разобраться, что здесь происходит. Ведь у бактерии тоже есть ДНК, в наших клетках есть ДНК, у бактерий есть ДНК, и у вирусов, как мы только что выяснили, есть ДНК. Пусть это будет ДНК бактерии, в которой находятся многочисленные гены, которые бактерии нужны для того, чтобы существовать.
Если к нашей клетке присоединился вирус и инъецировал туда свою собственную вирусную ДНК, это ДНК вирусы. Кстати, таких вирусов обычно в случае бактерий называют бактериофаги, потому что они буквально пожирают бактерии, фаг, это пожиратель вирусов, пожиратель бактерий.
Оказывается, клетка может иногда, если у клетки есть вот эта система защиты CRISPR-Cas, у нее, где-то внутри вот этой бактериальной хромосомы её ДНК есть специальный участок, который называется CRISPR и это просто сокращение с английского длинного научного термина. Но то, что для нас важно, что этот участок – это фактически память.
Что такое наша память? Память – это некое место у нас в мозгу, реально мы сами не знаем, где оно находится, куда мы складываем какие-то воспоминания, как в такой загашник, всё, что с нами происходило, всё, что мы прочитали и потом можем это использовать, если нам это необходимо.
Так вот выясняется, что вот в эту бактериальную память кусочки вирусной ДНК небольшие могут быть выбраны и вставлены сюда. Если бы такой процесс произошел, а в системе CRISPR-Cas он как раз и происходит, произошла бы вставка небольшого кусочка инфицирующей ДНК вирусов ДНК бактерии.
В большинстве случаев это случайный процесс. Конечно, он регулируется белками, всё, что происходит в клетке, контролируется генами, в том смысле, что гены кодируют белки, которые что-то делают. Это белки, ферменты, которые как бы позволяют нам быть тем, что мы есть, поглощать пищу, производить какие-то вещества и так далее. Вот конкретно у бактерий, у которых есть система CRISPR-Cas, есть набор генов, продукты которых позволяют им иногда узнавать случайный фрагмент вирусной ДНК и вставлять себе в память.
Удивительно, вот что, что если такой кусочек вставлен внутрь клеточной ДНК, то дальше бактерия приобретает способность бороться с вирусом, но не с любым вирусом, а только с тем вирусом, у которого есть участок, соответствующий вот этому воспоминанию.
Если клетка смогла запомнить вирус по тому, что в её участок памяти вставился небольшой кусочек вирусной ДНК, то дальше в таких клетках, если у них есть CRISPR-Cas – система, присутствует белок, мы его назовем Cas9, неважно, почему его так называют, но это, в сущности, молекулярные ножницы. Здесь есть специальный ген. Вот это ген Cas 9, участок ДНК, который кодирует вот такой белок.
Белок – это просто молекулярные ножницы, но они не дурные ножницы, которые кусают всё подряд, они кусают только очень правильные вещи. Фактически этот белок получает информацию о том кусочке вирусной ДНК, который вставился в память. Мы будем этот кусочек называть гид. Так же, как когда вы идете в какой-нибудь незнакомый город, вы можете нанять себе гида, который вам всё покажет.
И когда наши ножницы связались с таким гидом, то теперь эти ножницы приобрели способность программируемо узнавать вирусную ДНК, которая соответствует гиду и никакую другую. И после того, как это узнавание происходит, мы эту ДНК вирусную нашими ножницами разрезаем. Не здесь, не здесь, а именно в том месте, которое соответствует гиду.
Ну, понятно, после того как вирусная ДНК оказалась разрезана, то вот такой процесс инфекции не пойдет. На самой ранней стадии инфекции, еще только тогда, когда вирусная ДНК входит в клетку, она окажется разрезанной, и клетка выживет. А клетка это запомнила, как она вставила это воспоминание, как книжка вакцинации, медицинская книжка, свою собственную ДНК, то и все потомки этой клетки тоже будут это помнить.
Сначала гид попал из вируса в память, затем эта память реализуется, ведь ваша память тоже не обязательно функционирует всегда сама по себе, вот вы меня вспомнили только потому, что вы меня увидели, да, вот. И здесь тоже самое, то есть если вот, чтобы эта память заработала, нужно, чтобы гид попал на белок Cas 9 и теперь эти ножницы приобрели некий смысл.
Раньше они были такие совсем бессмысленные ножницы, а теперь они вооружены, у них есть такой, ну хотите, паспорт. Считайте, что это полицейский и у него есть объективка на то, что нужно кого-то поймать. Кого? Того, кто вот такой. Если такой вдруг сюда попадает, мы его тут же и убьём. Всё, привет. Ну и клетки живут, вот.
Очевидно, что у вирусов есть свои способы бороться с этим, иначе бы вирусы вымерли. Ведь когда вот я вам рисую эту картинку, понятно, что если бактерии должны спасаться от вирусов и убивать их, значит, вирусы должны как-то в этой войне участвовать, в гонке вооружений побеждать.
У вирусов есть анти-CRISPR системы. Многие вирусы, например, берут, и Cas9-белок убивают. У них есть специальный способ, когда они вместе со своей ДНК в клетку на всякий случай впрыскивают еще специальный белок, который Cas 9 убивает. Ну и, понятно, тогда клетке плохо, нужно еще что-то придумывать.
Но в принципе нас это не очень всё волнует. Или вернее не волновало до определенного периода, то есть то, почему CRISPR-Cas, это то, о чем сейчас все говорят, это вовсе не связано с тем, что нам интересно, как там бактерии борются с вирусами, нам интересны, конечно, мы сами, мы родные.
Значит, что вообще такое геномное редактирование? Это, в общем-то, геномное редактирование, Святой Грааль медицины. Дело в том, что очень много болезней есть, которые связаны с тем, что в последовательности ДНК клеток пациента произошло какое-то изменение, наследственное либо благоприобретенное, и изменилась именно последовательность букв, вот эти А, G, C, Т, они каким-то образом изменились.
Вот давайте нарисуем цепь ДНК, ну, не цепь ДНК, а вот эту знаменитую двуцепочную спираль. И представим себе, вот одна цепочка, вот другая, это очень короткий участок реально, конечно он будет огромным, с точки зрения количества витков и информации. И здесь есть некая последовательность букв: А, G, C… Это химические буквы, это не настоящие буквы, но химики, биологи просто предпочитают эти химические группы называть буквами.
И есть некое правило, по которому напротив вот этой цепочки синей есть правило отображения, когда против A всегда будет T, против G, С, ну и так далее, и тому подобное. Это все знают или должны знать из школы, а если не знают, то им должно быть стыдно.
И пусть у большинства здоровых людей последовательность ДНК вот именно в этом месте такая, а никакая другая. И пусть этот участок ДНК кодирует какой-то важный белок, например белок, активность которого не позволяет развиваться опухолям, ну в нормальном состоянии.
Может произойти мутация, мутация – это просто изменение ДНК. Смотрите, вот в нормальной ситуации у нас здесь буквы C, G, а так произошло, кому-то очень не повезло, что здесь стали буквы A, T. Эта мутация в том смысле, что состояние ДНК вот в этой конкретной позиции не нормальное.
Изменение генетической информации в виде последовательности ДНК приводит к тому, что у вас возникает какой-то поврежденный белок, который приводит к тому или другому нежелательному последствию. Надо сказать, что, вообще говоря, это редкое событие, потому что в большинстве своём такого рода изменения не приводят ни к чему.
Что же нам делать, если мы хотим этого несчастного пролечить? Можно придумывать какие-то лекарства, которые действуют на этот плохой белок, можно придумывать лекарства, которые действуют на плохие клетки, а можно хирургу позвонить, чтобы он там вырезал вам что-нибудь. Но в принципе, самый лучший способ – это геномное редактирование, самый такой вот, ну, уж дальше уже некуда, а именно.
Если бы мы могли, как геномные, как генетические хирурги или хирурги ДНК найти вот это место в клетках той ткани, которая оказывается повреждена в результате такой мутации, как на старой пишущей машинке затереть вот эти неправильные буквы, а поставить сюда правильный вариант, то тогда причина болезни исчезла. Мы вернулись бы реально в нормальное состояние. Принцип очень простой.
Есть только одна проблема: чтобы так сделать, надо найти и изменить букву в совершенно точном месте. Мы с вами говорим об изменении одной буквы на относительно небольшом участке ДНК.
Но дело в том, что размер нашей с вами ДНК, размер ДНК клетки человека, это 3 на 10 в девятой, то есть 3 миллиарда букв, такая длинная-длинная цепочка. Чтобы понимать, насколько это много, прекрасная книга «Война и мир» Льва Николаевича Толстого, которая, как все школьники знают, толстая, она содержит буквально пару миллионов букв. То есть здесь тысячи «Войн и миров». И там написано, что вы это вы, а я это я.
Причем это мы получаем только от мамы, еще столько же мы получаем от папы, у нас же два набора хромосом и два набор генов, у нас все гены закопированы. То есть мы должны найти вот это одно изменение в стопке книг, в тысяче книг размером с «Войну и мир», найти эту опечатку, прочитать как-то очень быстро и поменять её.
И при этом желательно сделать это точно, чтобы не внести никаких «очепяток» в другие места, потому что тогда только еще хуже сделаете. Как бы нам это сделать? В принципе, как это сделать понятно, потому что, вот смотрите, я написал, что у нас 3 на десять в девятой букв ДНК.
У нас с вами 23 хромосомы от папы, 23 хромосомы от мамы, каждая хромосома – это просто длинная молекула ДНК. Насколько длинная? Сколько, какой длины будет вот такая книга из миллиардов последовательностей букв A-G-C-T, учитывая то, что конечно ДНК – это просто крохотная молекула. Выясняется, это будет очень длинная молекула, если ДНК из каждой моей клетки взять, поставить на попа и распрямить, то она будет ростом приблизительно с меня, длиннющая такая штука. Из каждой клетки. А всего у меня триллионы клеток. В этом смысле надо к своему телу относиться очень уважительно, это вообще совершенно чудесная машина. И клетки, конечно же, делятся. Всякий раз, когда клетка делится, ДНК в ней удваивается и потом одна, один набор всех генов, и все молекулы ДНК идут в одну клетку, другой – в другую.
Представьте себе задачу, когда у вас есть такая тонюсенькая нитка длиной в мой рост, запутанная, как-то вот так упакованная в крошечную клетку, которую даже глазом не видно, а теперь вы должны скопировать, сделать копию этой ниточки и потом разделить её в две клетки. С большой вероятностью у вас ДНК будет рваться. Если вы пытаетесь это растащить, она у вас будет рваться, и это происходит реально. ДНК всегда рвется, особенно во время деления клеток.
В этом, собственно, одна из причин, почему в ходе жизни мы, в конечном счете, приобретаем рак. Потому что мы боремся с этими разрывами, клетки научились бороться с ними, но иногда они делают ошибки.
Итак, важное утверждение. Клетки умеют бороться с разрывами ДНК, все клетки. Те клетки, которые не умеют, умирают. Клетки умеют бороться с разрывами ДНК. И разрывы ДНК происходят всегда, с этим нужно просто примириться. С разрывами ДНК.
Как это делается? А вот как. Представьте себе, что это у нас папина молекула ДНК, а это соответствующая мамина молекула ДНК, и пусть случайно произошел здесь разрыв. Вообще говоря, катастрофа, просто ДНК порвалась. Но мы ведь знаем, что эти две молекулы одинаковые, да. Это от папы, это от мамы, но они в принципе одинаковые.
Оказывается, в клетке есть системы защиты вот от таких случайно возникающих разрывов. Как? А именно потому, что у нас вот это является копией этого, мы можем восстановить разрыв по незатронутой копии. Происходит это, те, кто еще помнит, это, наверное, похоже, наверное, до некоторой степени похоже с этой магнитофонной лентой, которая раньше на кассете, она рвалась, вот, и вы можете просто это соединить стык в стык, а можете просто наложить кусок из другой какой-то версии и всё восстановить.
Я это нарисую таким образом, что вот здесь у меня как будто бы произошел перехлест, и я этот разрыв залечил по этой здоровой копии. Те клетки, которые так не умеют делать, они болеют и умирают, и их на самом деле нету. Те люди, у которых нет специальных белков, которые умеют это делать, они, как правило, светочувствительные, вообще тоже очень нездоровые, потому что свет, просто солнечный свет вызывает у нас разрыв ДНК, сам по себе. То есть мы должны уметь зашивать эти разрывы.
Но тогда возникает идея, как это связать с геномным редактированием. А именно, представьте себе, что у вас есть генетическое заболевание, пусть не у вас, пусть у меня, вообще пусть у кого-нибудь другого, у кого-нибудь, кого мы не знаем. И это генетическое заболевание возникает с тем, что в копии гена, которая пришла от папы, содержит здесь в себе изменение, вот в духе того, что у нас здесь было, да. А мамина копия нормальная, да. Человек имеет одну дефектную копию гена и это ему делает сильно несчастным и больным.
Ситуация, когда человек имеет две дефектные копии гена и от мамы и от папы очень редка, и, как правило, такие люди даже не рождаются, они умирают внутриутробно. Раз мы знаем, что клетка умеет залечивать ДНК, то очень просто предположить, как мы можем с этим бороться в принципе.
Нам нужно каким-то образом раскусить, вот если бы у нас были ножницы, если бы у нас было такое чудо и мы могли бы ввести разрыв вот в то самое место, где произошла мутация, которая вызывает у нас проблемы, то что произойдет? Клетка будет рассматривать это просто как разрыв в ДНК, лечить она это умеет, и она залечит этот разрыв по здоровой копии вот таким образом, да. Всё прекрасно, мы вылечились.
Тогда наша проблема геномной медицины становится теперь несколько другой, мы можем задавать вопрос по-другому: как направленно или программируемо, вводить разрывы в ДНК? Ведь если бы мы это умели делать, мы могли бы лечить генетические болезни. Потому что клетка и так умеет зашивать разрывы, случайно происходящие. Всё, что нам нужно, как ученым, медикам, это научиться вводить эти разрывы не абы где, а там, где нам интересно.
Где нам интересно? Там, где есть мутации, которые приводят к каким-то генетическим заболеваниям. Откуда мы знаем, где эти мутации есть? Потому что у нас есть проект «Геном человека». Всё больше и больше геномов определяются им, медики мало-помалу находят вот все те изменения, которые ответственны за то или другое заболевание.
Теперь у нас третья часть лекции и это про то, как мы свяжем первые две вместе. Мы с вами знаем, что бактерии могут бороться с вирусами с помощью системы CRISPR-Cas, когда они запоминают вирус, а потом узнанную вирусную ДНК разрезают с помощью программируемых ножниц. Что запомнили, то и разрежут, да. А то, что не помнят, разрезать не могут. И с другой стороны мы с вами знаем, что есть генетические заболевания, которые в принципе можно было бы излечить, если бы мы могли в том месте, в котором произошла мутация, внести разрыв в ДНК. Дальше уже вопрос техники, клетка сама умеет починить разрыв по здоровой копии, всё прекрасно.
Как эти две вещи связаны? С одной стороны – бактерии, с другой стороны – серьезные проблемы, связанные с генетическими заболеваниями. Рак, психологические заболевания, муковисцидоз, заболевание крови, всё, что угодно. А вот как.
В исходной нашей ситуации наши молекулярные ножницы Cas 9, это белок из бактерий, заметьте, да, программируется гидом, который соответствует участку вирусного ДНК, вирусной ДНК для того, чтобы разрезать вирусную ДНК, и в этом биологический смысл.
А давайте наплюем на биологию, биотехнологи всегда плюют на биологию. Давайте запрограммируем наш белок гидом, последовательность которого пришла не из вируса, а последовательность которого соответствует измененной копии гена человека какого-то.
Оказывается это очень просто. Потому что гид – это просто кусочек нуклеиновой кислоты, его очень просто сделать. Тогда мы должны увидеть вот что. Нарисуем опять две соответствующие друг другу молекулы ДНК клетки человека из папы, из мамы и пусть у нас вот здесь находится какое-то генетическое, какая-то аберрация, мутация, которую нам нужно излечить.
Тогда, если мой гид будет запрограммирован на то, чтобы узнавать эту и только эту копию (а гид умеет наводить ножницы на определенные последовательности), вот этого отличия здесь одного, одной буковки достаточно, чтобы он эту копию не узнавал, а эту узнавал.
Что произойдет? Наши ножницы, узнав вот эту версию последовательности, её раскусят, больше нам Cas9 ни для чего не нужен, потому что всё остальное произойдет само собой, потому что клетка научилась это делать в ходе тысячи, миллиардов лет эволюции.
Или клетка умрет, ничего не произойдет в ряде случаев, или просто произойдет починка и в результате у нас вот по этой здоровой копии будет залатан этот разрыв. И, следовательно, в результате такого геномного редактирования мы изменили программируемым образом последовательность ДНК. Если у нас была одна копия ДНК, одна хромосома нормальная, а другая мутантная, то теперь у нас они обе нормальные.
Произошло это, мы какие-то самые разные барьеры преодолели, мы начали с биологии и защиты от вирусов. Мы, надо понимать, что мы в человеческую теперь уже клетку, всё это происходит внутри человеческой клетки, а может быть даже внутри человеческой яйцеклетки, как вот собственно в этих известных опытах, недавних, китайского ученого, который редактировал, ну, будущих детей.
Он взял яйцеклетку, в ней есть, конечно же, хромосомы, гены и так далее. И вот с помощью такой технологии ввел раскус в определенное место и изменил одну из версий хромосом. Ну, дальше возник человечек, потому что после того, как такое изменение произошло, клетка делится, всё идет нормально, возникает человечек.
Мы в человеческую клетку ввели бактериальный белок, это первое надо понимать. Мы этот белок запрограммировали не тем, чем он обычно программируется, не кусочком защитным от вирусной ДНК, от бактерий, а участком, который специфичен, который узнает определенный, нам интересный, фрагмент ДНК человека.
А дальше удивительным образом белок бактерии сработал в клетке человека так же, как он обычно работает в клетке бактерии. Дурные программируемые ножницы, на что их запрограммируешь, идеальный исполнитель, туда и укусят. Дальше всё прошло, как по маслу.
И понятно, что процедура настолько общая, что можно редактировать и клетки людей, и самих людей, если вы это делаете на эмбрионах, можно редактировать растения, можно редактировать сельскохозяйственных животных, если вам интересно изменить в какую-то сторону их генетические последовательности, можно редактировать бактерии, можно делать всё, что угодно. Другой вопрос, нужно знать, что ты делаешь. И в этом как бы и сила, и ограничение этого метода.
В большинстве случаев мы не знаем, какое изменение в ДНК отвечает за какое свойство. То есть если для ряда тяжелых болезней, например, для муковисцидоза, точно известно, где есть изменение, и точно понятно, что можно пролечить, то для свойств, как интеллект, рост, красота, чтобы это не значило, да, форма носа и так далее, таких изменений, таких изменений в ДНК не известно. Мы не знаем, что это такое.
И в этом смысле бояться того, что сейчас все начнут делать вот таких дизайнерских детей, как в меню, когда ты приходишь и заказываешь: мне вот здесь подкрутите, здесь и здесь, мы от этого очень далеко, и скорее всего никогда к этому и не придем, просто потому, что мы не знаем этого.
Но для лечения относительно простых заболеваний, вызванных изменениями в понятных генах, которые были медицинскими генетиками определены, ну, на протяжении последних ста лет, вот здесь, наверное, может быть прорыв в ближайшее время.
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru