CRISPR-маркеры
Органоиды – это мини-органы, которые можно выращивать в лабораторных условиях. Они растут из небольшого фрагмента ткани любого органа. Возможность генетически изменять эти органоиды очень полезна для изучения биологических процессов и моделирования заболеваний. Однако до сих пор получение генетически измененных органоидов было проблемой из-за отсутствия подходящих методов генной инженерии.
CRISPR-HOT
Несколько лет назад исследователи обнаружили, что инструмент CRISPR/Cas9, который представляет собой молекулярные ножницы, может точно разрезать нить ДНК в определенном месте. Эта технология продвинула генную инженерию вперед.
Повреждение ДНК активирует один из двух различных механизмов восстановления в клетках, которые могут использоваться исследователями для принуждения клеток к захвату новой части ДНК. Считалось, что один из этих методов – негомологичное соединение концов – часто дает ошибки и поэтому почти не использовался для вставки новых фрагментов ДНК. Тем не менее, некоторые более ранние работы на мышах показали, что новые фрагменты ДНК могут быть вставлены посредством негомологичного соединения концов.
Исследователи из Института Хюбрехта, Нидерланды, решили проверить метод на человеческих органоидах. Они обнаружили, что вставка любого фрагмента ДНК в органоиды человека посредством негомологичного соединения концов была более эффективной и надежной, чем метод, который использовался до сих пор. Они назвали свой новый метод CRISPR-HOT.
Ультраструктурное определение клеток печени человека. При окраске белка кератина, формирующего цитоскелет, становятся видны мелкие структурные детали скелета (синего цвета) в клетках протоков печени человека. Источник здесь и далее: Benedetta Artegiani и Delilah Hendriks, Hubrecht Institute.
Окрашенные клетки
С помощью CRISPR-HOT исследователи вставили флуоресцентные метки в ДНК человеческих органоидов таким образом, чтобы они были прикреплены к интересующим генам. Сначала они работали с энтероэндокринными клетками кишечника. Эти клетки вырабатывают гормоны, регулирующие такие процессы, как поддержание уровня глюкозы, потребление пищи и опорожнение желудка. Они крайне редки, поэтому их трудно изучать. Однако с инструментом CRISPR-HOT исследователи легко «покрасили» энтероэндокринные клетки в разные цвета, идентифицировали и проанализировали их.
Исследователи также пометили органоиды, полученные из клеток печеночных протоков. Используя CRISPR-HOT, они визуализировали белок кератин, формирующий скелет клеток. Это позволило рассмотреть кератин подробно и с высоким разрешением, они раскрыли организацию белка ультраструктурным способом и выяснили, что кератины по-разному экспрессируются во время специализации или дифференцировки клеток.
Исследователи предполагают, что CRISPR-HOT может быть полезен для изучения жизни и дифференцировки клеток.
Аномальное деление клеток в печени
В печени есть много гепатоцитов, которые содержат в два и более раза больше ДНК, чем обычные клетки. Как эти клетки формируются и способны ли они делиться из-за ненормального количества ДНК, неизвестно. В клетках пожилых людей содержится больше этих патологических гепатоцитов, но связаны ли они с такими заболеваниями, как рак, было непонятно. Исследователи использовали CRISPR-HOT для маркировки специфических компонентов деления клеток в органоидах гепатоцитов и изучили процесс деления клеток. Нормальные гепатоциты делились очень упорядоченно, образуя всегда две дочерние клетки. Но были обнаружены несколько отделов, в которых из нормальных гепатоцитов образовывались патологические. В дополнение к этому, исследователи изучили влияние мутации в гене TP53, часто встречающейся при раке печени, на аномальное деление клеток в гепатоцитах. Выключение TP53 приводило к гораздо более частому делению патологических гепатоцитов. Возможно, мутация TP53 является одним из механизмов, способствующих развитию рака печени.
Визуализация деления клеток печени человека. Здоровые (слева) органоиды демонстрируют организованное деление (стрелка), в то время как органоиды, в которых ген TP53 выключен (справа), показывают хаотические клеточные деления (стрелки).
Исследователи полагают, что CRISPR-HOT применим ко многим типам человеческих органоидов для визуализации любого гена или типа клеток, а также для изучения многих вопросов, связанных с развитием заболеваний.
Статья B.Artegiani et al. Fast and efficient generation of knock-in human organoids using homology-independent CRISPR–Cas9 precision genome editing опубликована в журнале Nature Cell Biology.
Аминат Аджиева, портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru по материалам Hubrecht Institute: CRISPR-HOT: a new tool to “color” specific genes and cells.