Полезная шпилька
РНК-шпилька увеличила точность CRISPR в 50 раз
Дарья Спасская, N+1
Американские исследователи показали, что добавление небольшого элемента вторичной структуры к направляющей РНК может существенно увеличить точность редактирования ДНК CRISPR-системами. Как поясняют ученые в статье в Nature Biotechnology (Kocak et al., Increasing the specificity of CRISPR systems with engineered RNA secondary structures), РНК-шпилька мешает нуклеазной активности Cas-белка на «неправильных» мишенях, но не мешает в случае точного соответствия последовательностей между направляющей РНК и мишенью.
Рисунок из пресс-релиза Duke University Engineering "Hairpins" Increases CRISPR Accuracy – ВМ.
Несмотря на значительный прорыв в области терапевтического применения CRISPR-редактирования (эти системы уже применяют для ex vivo редактирования генома отдельных клеток, например, лейкоцитов, и даже редактирования эмбрионов человека), ученых по-прежнему беспокоит точность работы CRISPR, которая нередко проявляет нецелевую активность в человеческом геноме. Увеличить точность узнавания и разрезания ДНК чаще всего пытаются путем внесения мутаций в CRISPR-эффекторы, в частности, белок Cas9. Тем не менее, такой подход, хоть и привел к созданию множества вариантов Cas с увеличенной специфичностью, чаще всего приводит и к существенному снижению эффективности редактирования на нужных мишенях.
Ученые из университета Дьюка подошли к проблеме с другой стороны и занялись настройкой РНК-компонента CRISPR. «Упрощенный» вариант CRISPR-системы, который используют в качестве инструмента редактирования в эукариотических клетках, включает эффектор (Cas9 или Cas12а) и направляющую РНК, которая содержит 20-нуклеотидный спейсер – участок, комплементарный последовательности в геноме, которую нужно порезать. Известно, что в точность узнавания основной вклад вносит первая часть спейсера. Исследователи предположили, что если оставшийся конец спрятать внутри вторичной структуры, точность редактирования увеличится.
Схема образования шпильки на 5'-конце РНК-спейсера (здесь и ниже рисунки из статьи в Nature Biotechnology).
Чтобы проверить гипотезу, авторы работы предсказали in silico и показали экспериментально, что добавление короткой последовательности, образующей с 5’-концом РНК-спейсера небольшую и не очень прочную шпильку, не снижает эффективности связывания Cas9 с мишенью, но при этом влияет на эффективность редактирования. Последний параметр проверяли на направляющих РНК против генов VEGFA и EMX1, у которых есть по несколько известных «оф-таргетов» (участков неспецифического связывания в геноме).
Оказалось, что для таких участков шпилька значительно снижает нежелательную активность – как по сравнению с контрольным немодифицированным спейсером, так и по сравнению с укороченным вариантом спейсера, где лишние буквы просто отрезали, и по сравнению со спейсером с довеском, не образующим шпильки. На нужном участке активность CRISPR при этом существенно не менялась (хотя вычисления предсказывали ее снижение). В среднем для ряда оф-таргетов увеличение точности «канонического» SpCas9 из Streptococcus pyogenes произошло в 55 раз. Увеличение точности в присутствии шпильки авторы также увидели для других используемых на практике эффекторов – SaCas9 из Staphylococcus aureus и разных форм Cas12a.
Эффективность разных направляющих РНК на целевом локусе в гене EMX1 (ON) и нескольких нецелевых локусах (OT). WT – немодифицированный спейсер, Hairpin – РНК со шпилькой, Truncated – обрезанный спейсер.
Обсуждая механизм наблюдаемого феномена, авторы работы предположили, что шпилька на конце спейсера ингибирует формирование комплекса РНК-ДНК (так называемой R-петли), которое необходимо для нуклеазной активности Cas-белка, в случае неточного спаривания ДНК-РНК, и таким образом, предохраняет систему от нецелевой активности. Самое главное в таком способе увеличения специфичности – его универсальность, так как направляющая РНК используется всеми CRISPR-системами, и ее просто синтезировать.
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru