Шредер вместо ножниц
CRISPR-каскад накрошил ДНК в клетках человека
Дарья Спасская, N+1
Генетики адаптировали для использования в клетках человека CRISPR-систему Cascade/Cas3 первого типа, в которой для распознавания и разрезания ДНК используется не один, а множество белков. Как сообщается в статье в Molecular Cell Dolan et al., Introducing a Spectrum of Long-Range Genomic Deletions in Human Embryonic Stem Cells Using Type I CRISPR-Cas, благодаря способности белка Cas3 вносить многочисленные разрезы на протяженных участках ДНК, эту систему можно использовать для создания больших делеций в человеческом геноме.
CRISPR-системы, которые были открыты как компонент бактериального «иммунитета» против вирусов, в природе весьма разнообразны, и включают как системы с одним белком-эффектором, так и с несколькими. Функции распознавания заданной последовательности и разрезания ДНК в системах второго типа выполняет единственный белок, что делает их особенно привлекательными для биотехнологии. Сюда относится система, включающая нуклеазу Cas9, которая в настоящее активно используется для редактирования геномов самых разнообразных организмов. Тем не менее, такие системы составляют не более 10 процентов от известных CRISPR-систем.
Самые распространенные в природе CRISPR-системы первого класса и первого типа включают в себя несколько эффекторов. Функции распознавания последовательности здесь играет многосубъединичный комплекс Cascade, а разрез в ДНК вносит хеликаза-нуклеаза Cas3. Работа комплекса Cascade/Cas3 интенсивно изучается в бактериях, но в эукариотических клетках ее до сих пор не использовали.
Исследователи из Корнелльского университета и Университета Мичигана решили проверить, как наиболее изученный Cascade из термофильной бактерии Thermobifida fusca поведет себя в эмбриональных клетках человека (эти клетки были выбраны как «здоровая» клеточная модель). Чтобы доставить комплекс в клетки, ученые экспрессировали в бактериях все семь субъединиц Cascade с пришитым к ним сигналом ядерной локализации, затем смешивали их с направляющей РНК и Cas3, и доставляли в клетки при помощи электропорации. Чтобы комплекс работал при 37 градусах, в одну из субъединиц ввели мутацию.
Схема оперона Cascade/Cas3 в геноме бактерии (рисунки из статьи в Molecular Cell).
Эффективность редактирования проверяли на примере репортерных генов – зеленого и красного флуоресцентного белков. Оказалось, что, несмотря на сложность сборки комплекса, он хорошо работает в человеческих клетках, точно распознает заданные последовательности и вносит разрывы в вышележащую последовательность ДНК. Комплекс вносил разрыв примерно в десяти процентах клеток, максимальная эффективность редактирования для выбранных направляющих РНК составила 13 процентов. Тем не менее, в случае другого гена в раковой клеточной линии HAP1 эффективность редактирования составила уже 30-60 процентов.
Одной из целей авторов работы было уточнение механизма работы белка Cas3. В отличие от Cas9, он не вносит одиночный разрыв в месте распознавания, а «приезжает» на Cascade в нужное место, затем отсоединяется и едет по ДНК еще достаточно далеко. Оказалось, что в эукариотических клетках в результате работы комплекса образуются достаточно большие делеции размером от нескольких сотен до десятков тысяч пар оснований.
По-видимому, Cas3, проезжая по ДНК, вносит несколько одно- или двухцепочечных разрывов, таким образом нарезая достаточно длинную последовательность ДНК на кусочки.
Конечно, если говорить о практическом применении в человеческих клетках, для точного редактирования Cascade/Cas3 не годится, замечают авторы работы. Однако более 90 процентов человеческого генома составляют некодирующие последовательности, и для изучения их функций нередко нужно удалять достаточно продолжительные участки хромосом. В этом случае Cascade мог бы пополнить генетический инструментарий для эукариот.
Помимо самого изученного белка Cas9 для редактирования генома человека ученые предлагали использовать и другие белки CRISPR систем второго класса – Cas12a (Cpf1), Cas13a, которая может выключать гены на уровне мРНК, и недавно обнаруженный «маленький» аналог Cas9 – CasX.
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru