Ставка на лошадку

Биологи приручают микроорганизмы для адресной доставки лекарств

Андрей Субботин, «Поиск»

Рак, диабет, ожирение, нейродегенеративные заболевания, настигающие людей в старости, воспалительные процессы – вот неполный перечень нерешенных медицинских проблем, с которыми сталкивается современный человек. В терапии таких заболеваний одно из ключевых мест занимают фармпрепараты на основе изопреноидных соединений стероидного ряда. Стероиды весьма распространены в природе, так как выполняют важнейшие функции во всем живом. Микроорганизмы способны разрушать молекулы стероидов или модифицировать их структуру. Сегодня именно микробиологическая трансформация фитостеринов (смеси стеринов растительного происхождения) является технологической основой получения синтонов, из которых потом производят такие фармацевтические препараты, как гормоны коры надпочечников, прогестины, минералокортикоиды, половые гормоны и негормональные стероиды. Их применяют в ветеринарии, пищевой промышленности, сельском хозяйстве. Согласно статистике, общие потребности мировой фармацевтики в субстанциях стероидов превышают 1500 тонн в год. Рынок производимых из них лекарств уступает лишь антибиотикам.

Открытие новых перспективных молекул, в том числе с противовирусным и нейропротекторным действием, рост спроса на витамин D, а также переориентация схем производства препаратов для гастроэнтерологии (таких, например, как желчные кислоты) на использование в качестве первичного сырья фитостеринов позволяют прогнозировать значительный рост потребности мирового рынка в стероидных синтонах. Микроорганизмы уже применяют для переработки фитостеринов в промышленных объемах в ряде стран (США, Германия, Индия, Китай, Испания и др.). Россия, имея огромные ресурсы в виде стеринсодержащих отходов лесохимического комплекса, еще не располагает производством полного цикла стероидных фармацевтических субстанций, в том числе жизненно важных лекарств. Поэтому потребности отечественного здравоохранения покрываются за счет импортных поставок. Между тем только 6 крупнейших целлюлозно-бумажных комбинатов нашей страны производят свыше 300 тысяч тонн талловых продуктов – стеринсодержащего сырья, которое в большинстве своем просто сжигается, вредя окружающей среде.

Решение этих проблем могут дать генетические технологии. Российский научный фонд финансирует проект «Метаболическая инженерия микробных продуцентов для промышленной биотехнологии: получение ценных изопреноидных синтонов из природных стеринов». По просьбе «Поиска» о том, как ведутся работы в рамках этого гранта, рассказала руководитель проекта доктор биологических наук Марина ДОНОВА, главный научный сотрудник Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина ФИЦ «Пущинский научный центр биологических исследований» РАН.

– Для промышленного получения синтонов из фитостеринов сегодня используют природные штаммы бактерий, не опасные для человека и животных, – сообщает, вводя в курс дела, Марина Викторовна. – Однако не решены проблемы, связанные с низкой производительностью используемых штаммов, неполной конверсией фитостеринов и образованием побочных продуктов, осложняющих очистку целевых стероидов. Еще сегодня важно расширить линейки целевых продуктов с высокой добавленной стоимостью, получаемые напрямую из фитостеринов. Это поможет сократить схемы производства конечных фармацевтических ингредиентов, заменить многостадийные химические синтезы одностадийными биотехнологиями, поднять рентабельность производств и снизить экологические риски. Собственно, для этого мы и изучаем механизмы функционирования и регуляции метаболических путей окисления стеринов у актинобактерий. Цель – создание промышленных клеточных биокатализаторов нового поколения. Благодаря им возможно не только улучшить свойства микробных штаммов путем подавления нежелательных ферментативных активностей, но и перенаправить метаболические потоки в клетке в сторону образования ценных стероидных и изопреноидных соединений. Новые пути открывает управляемая экспрессия чужеродных систем стероидогенеза в микробных хозяевах.

– Экспрессировать – это интенсифицировать?

– Это научиться преобразовывать наследственную информацию гена в функциональный продукт в бактериях или дрожжах. То есть получить соединение, обладающее определенными заданными свойствами.

– С какими именно бактериями вы работаете?

– Правильный вопрос. Важным является выбор «шасси», рабочей платформы микроорганизма, на основе которой будут создаваться эти новые микробные клеточные фабрики. К сожалению, такие традиционно используемые генетиками рабочие лошадки, как бактерии Escherichia coli, для которых создан солидный генетический инструментарий, малопригодны для этих целей. А сложность работы со стероидами уже в том, что они практически не растворимы в воде, – уточняет Марина Викторовна. – Например, растворимость холестерина не превышает 10 мг на литр, а промышленные катализаторы должны эффективно конвертировать стероиды в концентрациях, превосходящих их растворимость в десятки тысяч раз. Кроме того, надо, чтобы стероидный субстрат эффективно проникал в микробную клетку, для чего ей требуются гидрофобная поверхность и еще эффективные системы транспорта таких соединений. Мы стремимся больше узнать о геноме, собственных генах стероидов, регуляции их транскрипции, метаболоме микробного организма-хозяина, об особенностях каскадов реакций деградации стероидов и ферментов, – углубляется в детали Марина Викторовна, – поэтому рабочей лошадкой в нашем проекте выбраны микобактерии Mycolicibacterium smegmatis. Ранее для таких микроорганизмов мы разработали генетический инструментарий для создания мутантных штаммов с блоками на определенных этапах катаболического пути деградации стеринов.

– Как выстроен процесс исследований?

– Мы ведем его по нескольким направлениям. Во-первых, пытаемся переключить в клетках миколицибактерий потоки окислительной деградации боковой цепи стеринов на накопление нужных нам продуктов ее неполного окисления.

– Это – одно направление…

– А второе – создание трансгенных микроорганизмов, продуцирующих определенные гидроксистероиды. Их биологическая активность зависит от степени окисления молекулы и присутствия различных функциональных заместителей. Мы планируем получить трансгенные штаммы микобактерий, продуцирующих гидроксистероиды из природных стеринов на основе уникального бациллярного мутантного белка. Такой подход перспективен как для биопроизводства высоко востребованных гидроксилированных стероидов из фитостерина, так и для научных изысканий мирового уровня. В будущем эта методология может стать основой для создания других микробных биологически активных соединений различного терапевтического предназначения.

Кроме того, в работах по гранту, которые продлятся до 2024 года, предусмотрена реализация метода получения генно-инженерных штаммов, способных селективно гидроксилировать стероиды с помощью грибных ферментов.

– В отличие от бактерий грибы, как правило, не могут полностью разрушить стероидные молекулы. Образуются нежелательные для нас стероидные соединения, что существенно осложняет очистку получаемых продуктов, – поясняет Марина Донова. – Но в ходе ранее проведенных исследований трех сотен штаммов различных мицелиальных грибов удалось выявить несколько штаммов с уникальными свойствами. Это позволило не только подтвердить функции генов, но и получить рекомбинантные штаммы, способные к селективной продукции заданных гидроксистероидов. Мы попытаемся также создать штаммы, продуцирующие новые стероиды с противовирусной активностью, а также стероиды, эффективные против человеческих папиломавируса, ротавируса, риновируса, без цитотоксических эффектов. Недавно была показана in vitro высокая ингибирующая активность таких стероидов против коронавирусов SARS-CoV-2 и HCoV-OC43.

В целом в результате выполнения этого гранта РНФ мы рассчитываем не только получить новые научные данные об особенностях функционирования гетерологических P450 монооксигеназ в микробных хозяевах, но и расширить методологические подходы, создать перспективные для практики рекомбинантные штаммы. Исследования имеют приоритетный характер, и реализация заложенных в проекте идей может способствовать созданию инновационных биотехнологий, – подчеркнула Марина Викторовна. – Результаты важны не только для биотехнологического применения, но и для биомедицинских исследований, поскольку открывают перспективы определения новых мишеней для создания лекарств направленного действия.

– Для исследований такого масштаба нужны современное оборудование и хорошо подготовленные кадры.

– С этим у нас все в порядке. В коллективе есть специалисты в области микробиологии, генной инженерии, биоинформатики, химии, биотехнологии. Причем с опытом создания промышленных микробных продуцентов, разработки биотехнологий полного цикла для получения фармацевтических субстанций и интермедиатов стероидов, они уже выполняли крупные российские и международные проекты в сфере промышленной микробиологии и синтетической биологии. Более половины сотрудников – молодые ученые. Такая структура лаборатории позволяет нам не только создавать новые штаммы, но и разрабатывать технологии от идеи до конечного кристаллического продукта.

– Проект ведется не только на деньги РНФ. Кто еще поддерживает вашу работу?

– Софинансирование проекта осуществляет Биохимический холдинг «Оргхим». Это один из мировых лидеров в области производства продуктов «зеленой химии», прицельно занимающийся внедрением научных разработок в промышленность. Компании холдинга разрабатывают экологически чистые продукты «зеленой химии», включая перспективные, такие как фитостерин. «Оргхим» инвестирует в программы развития лесохимического комплекса, в его планы входит и реализация проектов по созданию новых технологий и препаратов из фитостеринов.

– Какие планы на будущее? Вы ведь уже задумываетесь о следующих шагах?

– В ближайших планах, конечно, выполнить данный проект и создать солидный задел для будущих исследований. Мы очень признательны РНФ за поддержку. Средства гранта помогли нам привлечь дополнительно ряд специалистов и докупить необходимое оборудование и расходные материалы. А интересных идей на будущее у нас много, хватило бы сил и возможностей их реализовать.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru