Супер-люцифераза

Российские учёные получили белок-мутант, излучающий много света

Алексей Шабельский, «Информнаука»

Чтобы понять, что происходит внутри клетки в режиме реального времени, учёные часто используют биолюминесцентные белки-репортёры с красивым названием «люцифераза» (от слова «люцифер» – светоносец). По тому же пути пошёл и коллектив российских исследователей из Института биофизики СО РАН, пытаясь подсмотреть за внутриклеточными процессами.

Сибирские учёные клонировали ген, кодирующий люциферазу морских копепод (ракообразных), и модифицировали этот белок, ответственный за свечение этих организмов, с помощью генноинженерных методов.

Изучив интенсивность люминесценции таких молекул, исследователи впервые продемонстрировали, что модифицированные белки испускают в пять раз больше света, чем их природные, не изменённые аналоги. Результаты работы опубликованы в Biochemical and Biophysical Research Communications (Markova et al., High-active truncated luciferase of copepod Metridia longa).

Пожалуй, сегодня не найдётся ни одной крупной фармацевтической компании, которая не использовала бы в доклинических испытаниях лекарственных препаратов биолюминесцентные системы мониторинга. Для того, чтобы выводить эти эксперименты на новый уровень, необходимо ещё более чётко представлять, какие процессы происходят внутри клетки в режиме реального времени. Это довольно сложно, поэтому в мире не так много научных групп ставят перед собой такие задачи. По одному коллективу есть в США, Японии и России. У нас этими исследованиями занимаются учёные Института биофизики СО РАН. Они решили заглянуть в клетку, используя модифированные светящиеся белки – люциферазы. Их выбор основывался на том, что ранее лаборатория уже работала с геном метридий, кодирующим люциферазу этих организмов.

«В некоторых случаях длительный мониторинг внутриклеточных событий с помощью люцифераз в режиме реального времени сопряжён с определёнными трудностями, особенно если в качестве белка-репортёра используется люцифераза светляков, для биолюминесцентной реакции которой помимо специфического субстрата люциферина требуется кислород, АТФ и ионы магния, – поясняет заведующий лабораторией фотобиологии института, руководитель исследования Евгений Высоцкий. – Непросто поддерживать такое большое число компонентов реакции на постоянном уровне внутри клетки. Люцифераза Metridia longa лишена этих недостатков, так как для биолюминесценции необходим только сам светящийся белок, субстрат – целентеразин, и кислород. Кроме того, эта люцифераза относится к классу секретируемых ферментов, т.е. после синтеза в клетке белок «выделяется» клеткой в окружающее пространство. Таким образом, это позволяет проводить мониторинг внутриклеточных событий с высокой чувствительностью без разрушения самих клеток и тканей».

В ходе исследований под руководством Евгения Высоцкого учёные клонировали ген, кодирующий белок из морских копепод Metridia longa, который катализирует реакцию с излучением света. Затем с помощью генетических манипуляций они направленно изменяли нормальное положение аминокислот в белке, в результате чего получили мутантные формы белка. Кодирующие такие белки нуклеотидные последовательности вставлялись в плазмиды – кольцевые молекулы ДНК, закрученные в сверхспираль и способные к самовоспроизведению в клетке-хозяине. Плазмиды в свою очередь внедрялись в клетки бактерий кишечной палочки Escherichia coli, после чего эти клетки становились способными к синтезу люциферазы метридий. Из них учёные выделяли мутантные формы белка, их очищали и тщательно исследовали.

Как правило, белковые молекулы, или по-другому ферменты, состоят из различных функциональных участков, порой не вовлечённых непосредственно в процесс катализа. В случае люциферазы из Metridia longa не влияющими на биолюминесцентную активность оказались аминокислоты, расположенные в так называемой N-концевой части люциферазы. Фактически простое усечение N-концевых частей (сторона молекулы, завершающаяся аминогруппой) люциферазы метридий привело к значительному, в пять раз, увеличению интенсивности свечения и эффективности биолюминесцентной реакции. В дополнение авторы показали, что люцифераза метридий с удалённой в определённой позиции аминокислотой хорошо подходит на роль репортёрного белка в клетках млекопитающих. Люминесцентный анализ, проводимый с использованием таких белков, показывает большую чувствительность, чем аналогичный анализ с применением природных ферментов.

Как отмечает Евгений Высоцкий, для секретируемых люцифераз увеличение активности за счёт усечения фермента продемонстрировано впервые.

Авторы работы участвуют в проекте мегагрантов второй волны по привлечению ведущих учёных для работы в вузах России. (Гранты 16.512.11.2141 и 64987.2010.4 Министерства образования и науки РФ). В рамках этого гранта в Сибирском федеральном университете лабораторию будет создавать лауреат Нобелевской премии по химии за открытия в области флуоресцентных белков японец Осаму Шимомура.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru
22.05.2012