От лаборатории на чипе – к лаборатории на волокне

В настоящее время для проведения лабораторных анализов требуется весьма дорогостоящее оборудование и реактивы, нуждающиеся в хранении в строго определенных условиях, а также работа высококвалифицированных специалистов. Поэтому за кажущейся простотой процедуры забора крови для анализов кроются большие финансовые и временные затраты. Эти затраты являются одной из основных причин роста стоимости медицинских услуг во всем мире.

Более того, в сельскохозяйственных регионах и развивающихся странах эта ситуация усложняется тем, что пациентам приходится добираться в клинику в течение нескольких часов или даже дней. В таких условиях они часто не возвращаются для того, чтобы забрать результаты, а многие из них просто не могут позволить себе диагностику таких опасных для жизни заболеваний, как малярия или туберкулез.

Единственным способом преодоления этих проблем является усовершенствование инструментов лабораторной диагностики. Они должны быть дешевыми и портативными настолько, чтобы их можно было использовать в любых условиях. Они должны быть настолько простыми в использовании, чтобы медсестры, персонал хосписов, солдаты и даже сами пациенты могли проводить тестирование с минимальной подготовкой. И наконец, лабораторные инструменты нового поколения должны обеспечивать быстрое получение точных результатов, что позволит избавить пациентов от ожидания и волнения.

Выполнение всех этих требований отнюдь не является научной фантастикой. Ключом к достижению желаемого является использование оптоволокна, практически не отличающегося от тех, которые окутали весь мир сетью, обеспечивающей непрерывный высокоскоростной обмен огромным количеством информации.

Новая технология получила название «лаборатория на волокне». Помимо того, что она является доступной альтернативой традиционным лабораторным технологиям, она предоставляет недоступные ранее возможности. Например, такие волокна можно размещать внутри промышленного оборудования для обеспечения контроля качества продукции и выявления утечек. Их можно использовать для мониторинга качества воды в каналах и очистительных системах, для изучения состава океанской воды и как индикаторы для выявления химической угрозы. В будущем, возможно через несколько десятков лет, их можно будет вводить в организм человека для наблюдения за динамикой заболевания или метаболизмом лекарственных препаратов.

Диагностика с помощью света

Для функционирования лаборатории на волокне используются световые волны ближней части инфракрасного диапазона, что позволяет с высокой точностью определять концентрации химических соединений и биологических молекул в растворе. На рисунке схематично изображен принцип работы устройства.

• Лазер передает световую энергию на СЕРДЦЕВИНУ волокна.
• НАКЛОННАЯ РЕШЕТКА отражает световые волны с определенными (резонансными) значениями длины волны от сердцевины волокна.
• При связывании МОЛЕКУЛ-МИШЕНЕЙ с рецепторами на поверхности волокна происходит сдвиг длины волны и изменение интенсивности резонанса.
• ЗОЛОТОЕ ЗЕРКАЛО на торце волокна отражает сохраняющиеся в сердцевине световые волны в обратную сторону – на спектрометр, располагающийся на противоположном торце волокна.
• СПЕКТРОМЕТР (отсутствует на изображении) регистрирует изменения возвращенного света, что позволяет оценить концентрацию молекул-мишеней.

Впервые исследователи задумались о создании малозатратных мобильных лабораторий в конце 1960-х годов. В то время инженеры научились размещать тысячи (в конечном итоге – миллиарды) транзисторов на одной плате размером с ноготь, что положило начало разработке мощных микропроцессоров, а также работающих с большой скоростью запоминающих устройств большой емкости. По мере усовершенствования микроэлектромеханических систем их все более активно используют в биомедицинских исследованиях для создания компактных микрочипов, представляющих собой множество сенсоров, размещенных на одной миниатюрной плате из оксида кремния.

Дизайн и сложность таких систем, известных как лаборатория на чипе, варьируют в широких пределах. Типичный комплект включает в себя миниатюрные насосы и клапаны, направляющие движение небольшого образца жидкости, например, капли крови, по микроканалам к разным зонам регистрации. В этих зонах содержащиеся в крови молекулы-мишени, такие как глюкоза или антитела к определенным вирусам, реагируют с нанесенными на поверхность чипа соединениями, что изменяет напряжение на электродах или силу тока в проводнике. Микросхема усиливает эти сигналы, оцифровывает и анализирует их, после чего они выводятся на портативный дисплей по проводам или с помощью радиоволн. Весь процесс занимает не более 20 минут.

Сенсоры, созданные по принципу технологии «лаборатория на чипе», идеальны для использования в удаленных клиниках или непосредственно у кровати пациента. Однако их повсеместному применению для выполнения других задач препятствуют совершенно непреодолимые обстоятельства. Например, во влажной среде (внутри организма или на открытом воздухе) металлические проводники чипов подвергаются эрозии или в них происходит короткое замыкание, что делает невозможным корректное функционирование сенсоров. Кроме того, при производстве многих чипов используются токсичные для человека вещества, такие как мышьяк. Однако самым большим их недостатком является размер. Современные элементы питания, процессоры и передатчики позволяют создавать устройства размером не менее нескольких квадратных сантиметров, что не позволяет вводить их внутрь кровеносных сосудов.

Для преодоления этих проблем исследователи ищут способы замены электрических цепей оптическими. Использование световых волн вместо электрического тока для регистрации химических реакций позволяет фотонным чипам работать в водных растворах, делает их невосприимчивыми к электромагнитным излучениям, обеспечивает возможность их использования в широком диапазоне температур, а также минимизирует риски для биологических тканей.

Световые волны имеют еще одно важное преимущество. Электронные устройства передают информацию с помощью одного количественно оцениваемого параметра – силы тока или напряжения. Оптические устройства схожим образом кодируют данные посредством изменения интенсивности или амплитуды световых волн. Кроме того, световое излучение можно разделить на множество компонентов с разными длинами волн, что предоставляет возможность использования множества каналов передачи данных. Это значительно увеличивает информационную емкость цепи, в несколько раз повышая чувствительность фотонных лабораторий на чипе по сравнению с электронными.

Однако, несмотря на множество многообещающих качеств, создание «лаборатории на волокне» до сих пор связано с несколькими серьезными сложностями. Так же, как электронные чипы, оптические системы слишком велики для внедрения в организм. В этом отношении они даже уступают электронным чипам, так как световые волны нельзя «сжать» до размеров, меньших длины волны. Поэтому фотонные чипы, использующие свет ближней части инфракрасного диапазона, длина волн которого составляет примерно 1 микрометр, гораздо больше своих электронных аналогов, состоящих из кристаллов размером меньше 30 нанометров.

Изготовление сенсоров для фотонных лабораторий на чипе также ассоциировано с большими финансовыми затратами, так как оно требует изготовления сложных систем линз и зеркал, которые формировали бы световые лучи и направляли световые волны к зонам химической регистрации. Фотонные интегральные схемы на кремниевой основе, в настоящее время используемые в производстве оборудования для передачи данных, стоят по несколько сотен долларов. В то же время электронный чип можно приобрести буквально за копейки.

Что позволит преодолеть эти недостатки и в полной мере использовать чудесные свойства световых волн? Перспективным вариантом является замена фотонных чипов на стекловолокно.

С тех пор как в 1980-х годах стекловолокно стало дешевым доступным материалом, исследователи экспериментируют с различными методами создания сенсоров для лаборатории на волокне. В настоящее время несколько групп уже предложили свои концепции комбинирования материалов и методов сборки для дешевого крупномасштабного производства стабильно работающих систем.

Например, ученые из университета Карлтон в Оттаве (Канада) совместно с коллегами из университета Монса (Бельгия) и Цзинаньского университета (Китай) работают над созданием лаборатории на волокне, которая, несмотря на простоту производства, обеспечивает получение исключительно точных результатов.

Процесс производства подразумевает использование очень дешевого стандартного волокна, применяемого в телекоммуникационной аппаратуре. Эти волокна, толщиной с человеческий волос, имеют сердцевину и внешний слой, покрытый защитной полимерной оболочкой. Тогда как внешний слой состоит из чистого оксида кремния, сердцевина имеет вкрапления оксида германия, увеличивающие коэффициент преломления – параметр, указывающий на скорость прохождения света в материале. При попадании перемещающихся по сердцевине световых волн на внешнюю оболочку под определенным углом небольшая разница между коэффициентами преломления двух слоев обеспечивает возвращение светового пучка обратно в сердцевину. Благодаря этому явлению, известному как полное внутреннее отражение, световые волны могут перемещаться по сердцевине оптоволокна на многие километры по траектории, напоминающей траекторию движения мячика в настольном теннисе. Способность перемещать световые волны на большие расстояния с минимальными потерями позволит использовать лаборатории на волокне для поддержания функционирования систем, погруженных в воды океана, либо обслуживающих множество клиник одновременно.

Где разместить зонд?

Одним из лучших подходов к созданию лаборатории на волокне является размещение химического детектора или зонда на внешней поверхности оптического волокна (см. иллюстрацию «Диагностика с помощью света»). Однако это не единственный вариант. Ниже проиллюстрированы две наиболее перспективные альтернативы.

На торце

Золотые наноструктуры, размещенные на торце стандартного оптоволокна, отражают световые волны обратно на детектор, расположенный на противоположном конце. Когда молекулы-мишени прикрепляются к химическим рецепторам на данном покрытии, они увеличивают его толщину, что изменяет свойства отражаемого света. Этот подход разработан исследователями университета Саннио, Италия.

Внутри волокна

Этот принцип подразумевает использование «микроструктурированного волокна», направляющего световой пучок внутри воздушного тоннеля, окружающего полую или цельную стеклянную сердцевину. После введения в сердцевину или другие полости газообразного или жидкого образца его химические свойства определяются посредством анализа спектрального профиля света, доходящего до торца волокна. Подход разработан исследователями Института науки света им. Макса Планка, Германия и Технического университета Дании.

Для превращения инертного волокна в химический сенсор необходимо выбрать принцип размещения зоны регистрации. Некоторые группы рассматривают вариант размещения зонда на торце волокна или внутри воздушного тоннеля во внешнем слое волокон экспериментального типа, известных как микроструктурированное оптоволокно (см. врезку «Где разместить зонд?»). Однако канадские исследователи пришли к выводу, что наиболее простым и, соответственно, дешевым является использование сегмента внешней поверхности волокна длиной 1-10 мм.

На этот сегмент наносится химическое соединение, реагирующее с молекулами-мишенями, такими как содержащиеся в крови ферменты или, например, биологически активными веществами. Существует множество различных соединений, которые можно использовать в качестве таких реагентов, а также множество методов их нанесения на поверхность волокна. Один из наиболее перспективных подходов осуществляется в два этапа. Сначала на поверхность с помощью одного из стандартных методов (напыление, термовакуумное испарение или осаждение методом химического восстановления) наносится тонкий слой металла. После этого зонд погружается в солевую баню, содержащую раствор аптамеров – коротких синтетических цепочек ДНК, специфически связывающихся с молекулой-мишенью, которые прикрепляются к нанесенному на поверхность покрытию.

Химические компании могут синтезировать огромное количество аптамеров, реагирующих с различными молекулами, в том числе белками, токсинами и даже соединениями, входящими в состав оболочки живых бактерий. Это позволяет создавать оптоволоконные зонды для выявления практически любой химической или биологической субстанции. Использованный зонд можно очистить от исходных аптамеров с помощью химической промывки и подготовить его для вторичного использования путем нанесения необходимых новых аптамеров.

После того, как волокно приобрело способность связывать молекулы-мишени, осталось только научиться считать их. Для этого используется свет. К одному концу волокна прикрепляется миниатюрный источник света, например, лазерный диод, естественным образом направляющий свет через сердцевину волокна к химическому зонду. Противоположный торец волокна закрывается золотым зеркалом, что позволяет анализировать возвращенные волны с помощью обычного спектрометра.

Однако эти отраженные волны ничего не скажут об изменениях, происходящих на поверхности зонда, таких как присоединение молекул-мишеней к аптамерам. Для того, чтобы зарегистрировать эти изменения, свет должен иметь возможность взаимодействовать с внешней поверхностью зонда, на которую нанесены аптамеры. Поэтому необходимо каким-то образом заставить свет покинуть сердцевину волокна.

Многие более ранние варианты решения проблемы подразумевали удаление части внешнего слоя волокна путем полировки или химической гравировки, что обеспечило бы выход световых волокон наружу. Однако такие воздействия уменьшают прочность волокна. Более того, их выполнение требует высокой точности, что существенно усложняет и удорожает производство.

Канадские исследователи предложили решение, заключающееся в создании в сердцевине волокна так называемой наклонной решетки. По сути она представляет собой постоянную голограмму, создаваемую путем воздействия на волокно мощным ультрафиолетовым лазером в течение нескольких минут перед нанесением металлического покрытия и реагента. Для этого вокруг области зонда сначала растворяется пластиковый буфер, что делает его прозрачным для ультрафиолета. Луч лазера проходит через фазовую маску, представляющую собой покрытую канавками стеклянную пластинку, что разделяет его на два луча. Волокно помещается за фазовой маской, где световые волны накладываются друг на друга, формируя так называемую зону интерференции, в которой интервалы высокой интенсивности излучения перемежаются с интервалами отсутствия излучения. Это приводит к разрыву определенных молекулярных связей в материале сердцевины волокна, повышая его коэффициент рассеяния в зонах, соответствующих интервалам высокой интенсивности излучения. В результате формируется так называемая решетка, состоящая из зон с более высоким коэффициентом отражения.

Эти зоны имеют форму дисков и выступают в роли несовершенных зеркал, каждое из которых отражает небольшое количество света, перемещающегося внутри зонда. При их расположении перпендикулярно волокну свет отражается в обратном направлении и возвращается к своему источнику. Для того чтобы отраженный свет перенаправлялся к поверхности волокна, во время лазерной обработки волокно располагается под углом, что обеспечивает формирование наклонной решетки.

Важным моментом является то, что отражающая решетка не перенаправляет весь световой пучок из сердцевины. Она отражает только световое излучение с резонансными значениями длины волны, определяемыми расстоянием между отражающими дисками и преломляющими свойствами волокна. Когда резонансные световые волны покидают сердцевину, они отражаются от поверхности волокна и проходят обратно через его внутренний слой. В таких условиях они преодолевают всего лишь несколько сантиметров, после чего полностью абсорбируются внешней пластиковой оболочкой волокна. Поэтому посредством анализа спектра световых волн, возвращенных золотым зеркалом на спектрометр, можно идентифицировать пропавшие резонансные длины волн и оценить потери интенсивности излучения.

При помещении зонда в анализируемый раствор, например кровь человека, молекулы-мишени связываются с аптамерами на его поверхности, изменяя ее способность отражать и поглощать свет. Такая небольшая физическая трансформация меняет значение резонансной длины волны. Последующий анализ характеристик и выраженности этих изменений позволяет определить концентрацию молекул, вступающих в реакцию с покрытием зонда.

Чувствительность такого прибора зависит от материала, используемого для прикрепления связывающихся с молекулами-мишенями аптамеров к поверхности зонда. Металлическое покрытие способно повысить чувствительность лаборатории на волокне на 4 порядка.

Это объясняется достаточно странными законами физики. Толщина покрытия, как правило, варьирует в диапазоне 10-100 нанометров, что соответствует примерно 1/100 длины волны достигающего его резонансного излучения. При изготовлении покрытия из любого другого материала бОльшая часть этих световых волн прошла бы через него, никак не реагируя на изменения, происходящие с покрытием поверхности, такие как прикрепление молекул-мишеней к аптамерам.

Критичное покрытие. Нанофрагменты металлического напыления (коричневого цвета) на поверхности волоконного зонда формируют «горячие точки» электромагнитной энергии (желтого цвета). Этот слой повышает чувствительность лаборатории на волокне на 4 порядка.

Однако металлическое покрытие обладает уникальными свойствами, заставляющими световые волны вступать с ним во взаимодействие. Металл является проводником, электроны его поверхностного слоя осциллируют в электромагнитном поле, генерируемом световой волной. В определенных условиях, обеспечиваемых длиной волны, углом падения света и свойствами материала поверхности, осцилляции электронов в наночастицах металлического покрытия резонируют с осцилляциями электромагнитного поля. Такие резонансы электронов называют локализованными поверхностными плазмонами. Подобно тому, как воздух внутри гитары усиливает звук вибрирующих струн, они абсорбируют энергию индуцирующей электромагнитное поле световой волны, создавая горячие точки электромагнитной энергии, которые могут распространяться на несколько сотен нанометров за пределы поверхности металла. Плазмоны гораздо крупнее наночастиц, вокруг которых они формируются, что значительно повышает вероятность того, что световая волна отреагирует на происходящие на поверхности зонда молекулярные процессы.

В одном из экспериментов исследователи продемонстрировали, что не имеющее металлического покрытия стекловолокно позволяет регистрировать биотин (он же – витамин Н, витамин B7, кофермент R) в концентрации 20 микрограммов на литр тестового раствора. В то же время зонд с золотым покрытием уменьшает минимальную регистрируемую концентрацию этого витамина до 2 нанограммов на литр. Это примерно соответствует концентрации, получаемой при растворении щепотки поваренной соли в 25-метровом плавательном бассейне. (Золото использовалось для покрытия зонда из соображений его инертности и безопасности для организма.)

Благодаря миниатюрности и исключительно высокой чувствительности технология лаборатории на волокне может использоваться для выполнения множества разнообразных задач. Например, в 2012 году исследователи католического университета Лейвена, Бельгия опубликовали работу, в которой они использовали покрытые золотом зонды для выявления самых маленьких из возможных вариаций во фрагментах ДНК. Полученные ими результаты свидетельствуют о том, что в будущем этот недорогой инструмент может обеспечить возможность проведения быстрого и точного генетического скрининга на такие сложные заболевания, как муковисцидоз, различные типы рака и определенные инфекции.

Освещая жизнь: лаборатория на волокне использовалась для регистрации роста живых клеток кожи (фиолетового цвета). Фотография сделана с помощью флуоресцентного микроскопа.

Совсем недавно канадские исследователи из университета Карлтон продемонстрировали, что лабораторию на волокне можно использовать для мониторинга жизнедеятельности клеток. В рамках этого эксперимента они погрузили зонд в культуру клеток кожи, часть которых адгезировалась к его поверхности. При поступлении питательных веществ клетки делились, повышая плотность поверхностного слоя зонда, что изменяло профиль светового излучения, поступающего к спектрометру. И, напротив, под действием токсинов клетки погибали и слущивались с поверхности зонда, что снижало плотность его поверхностного слоя и проявлялось другими изменениями спектрограммы. Подобные сенсоры можно использовать для изучения живых тканей, так как они настолько малы, что не могут повлиять на поведение клеток.

Конечной целью работы канадских исследователей является создание лаборатории на волокне, которую можно будет вводить в организм человека для мониторинга происходящих в нем биологических изменений в реальном времени. Они уже планируют эксперименты, целью которых будет оценка возможности использования оптоволоконного зонда для выявления метастазирующих клеток в кровотоке. Первый этап этой работы будет проведен в условиях лаборатории, а второй – на животных моделях. Ученые надеются в прямом смысле этого слова пролить свет на процесс, посредством которого злокачественные клетки проникают в здоровые органы. Они также надеются, что их усилия помогут в разработке новых методов скрининга на наличие онкопатологии, менее инвазивных, чем традиционные подходы, такие как биопсия. Например, врач будет вводить оптоволоконный зонд в кровеносный сосуд с помощью иглы одноразового шприца. Эта процедура будет не более болезненной, чем обычный укол в вену.

Скорее всего, появление лабораторий на чипе на коммерческом рынке произойдет не раньше, чем через пять лет. Одной из трудностей, которую еще предстоит преодолеть разработчикам, является повышение стабильности покрытия поверхности зонда для обеспечения возможности его хранения в течение нескольких месяцев без утраты способности связываться с молекулами-мишенями.

В любом случае, технология лаборатории на волокне во многих областях биомедицины уже очень близка к тому, чтобы конкурировать в экономической эффективности и качестве результатов с существующими методами диагностики. Первой ласточкой вполне может быть анализ крови. Представьте себе, что вы берете набор для диагностики, самостоятельно делаете укол в подушечку пальца и выдавливаете каплю крови на систему оптоволоконных зондов. В течение нескольких минут аппарат автоматически отсылает полученные результаты по электронной почте вашему лечащему врачу, который свяжется с вами в течение нескольких часов и поможет решить проблему.

Статья Yanina Shevchenko et al. Surface plasmon resonance fiber sensor for real-time and label-free monitoring of cellular behavior опубликована в журнале Biosensors and Bioelectronics.

Евгения Рябцева
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru 

31.03.2014