Секвенирование ДНК: нанопора с моторчиком
Новый метод секвенирования ДНК обещает революцию в генной инженерии
Александр Малянов, Информнаука по материалам ScienceNOW и PhysOrg
Исследователи из Университета штата Вашингтон (University of Washington) под руководством профессора физики Йенса Гундлаха (Jens Gundlach) разработали датчик, позволяющий быстро и недорого определять генетический код по изменению уровня тока при пропускании цепи ДНК через нанопору. Работа, обещающая революционные изменения в процедуре секвенирования геномов, опубликована в последнем номере Nature Biotechnology (Manrao et al., Reading DNA at single-nucleotide resolution with a mutant MspA nanopore and phi29 DNA polymerase).
Идея определять последовательность нуклеотидов в ДНК, измеряя изменения ионного тока, создаваемые каждым нуклеотидом при последовательном прохождении одноцепочечной макромолекулы через ионный канал (нанопору), обсуждалась среди молекулярных биологов и биофизиков давно. Однако рабочую систему такого типа удалось создать лишь сейчас. (На самом деле «системы такого типа» продаются уже давно, а в течение года на рынке должны появиться еще как минимум два секвенатора ДНК на основе нанопор – ВМ.)
Ранее группа Гундлаха экспериментировала с протаскиванием ДНК через ионный канал мутантной формы порина A – одного из мембранных белков-каналов бактерии Mycobacterium smegmatis (MspA). Небольшая разность потенциалов в водном растворе хлорида калия по разные стороны мембраны проталкивает ионы сквозь пронизывающую её нанопору. При вхождении в ионный канал молекула ДНК частично перекрывает поток ионов, и по величине уменьшения тока легко понять, какой именно из четырёх типов нуклеотидов – аденин, гуанин, тимин или цитозин – проходит в данный момент через нанопору.
Однако проблема состояла в пропускании цепи ДНК сквозь канал с более-менее постоянной скоростью – достаточно быстро для того, чтобы такой метод секвенирования имел смысл, но при этом чтобы ионный ток успевал измениться и эти изменения можно было зафиксировать с помощью современной электронной аппаратуры.
Решить эту непростую задачу удалось, присоединив к порину ДНК-полимеразу фага (бактериального вируса) phi29 – генетического паразита бактерий Bacillus subtilis. Этот компонент обеспечил равномерное и с нужной скоростью протаскивание ДНК через канал, как делает это при репликации ДНК (постройке комплементарной цепи ДНК на матрице имеющейся).
«Мы дополнили разработанные нами белковые нанопоры мотором, который способен провести молекулу ДНК сквозь нанопору», – говорит профессор Гундлах. Такой двигатель впервые был использован исследователями из Университета Калифорнии в Санта-Крус (University of California at Santa Cruz), но применявшийся ими ионный канал был слишком широким для того, чтобы надёжно различать типы нуклеотидов по изменениям ионного тока.
В статье в Nature Biotechnology (учёные сообщают об успешной демонстрации новой технологии с использованием шести различных цепочек ДНК длиной от 42 до 53 нуклеотидов. ДНК-полимеразный мотор обеспечивает прохождение через пору каждого нуклеотида цепи ДНК в среднем за 28 мс. Изменение тока ионов через канал при прохождении нуклеотида составляет до 40 пА и достоверно отличается для каждого из четырёх типов составляющих наследственную молекулу нуклеотидов. Эти параметры позволяют успешно определять нуклеотидную последовательность ДНК, причём намного быстрее, чем в применяемых ныне методах секвенирования.
Работа американских учёных открывает перспективы фантастического ускорения и удешевления процедуры определения генетических последовательностей, что позволит уже в ближайшем будущем секвенировать геном каждого человека, а также определения изменений ДНК в реальном времени при конкретных заболеваниях. Это многократно ускорит и увеличит возможности генной инженерии – от создания совершенно новых, не существующих в природе видов до полного излечения наследственных заболеваний и победы над смертью.
Работа финансировалась Национальным научно-исследовательским институтом генома человека (National Human Genome Research Institute) в рамках программы поиска технологии, позволяющей осуществлять отдельные секвенирования менее чем за 1000 долларов. По словам профессора Гундлаха, до сих пор стоимость одного исследования измерялась сотнями тысяч долларов, но с новой технологией его можно будет провести всего за 10 долларов и 15 минут.
Кроме того, разработанный метод секвенирования позволит решить ещё одну важнейшую задачу, стоящую перед современной молекулярной биологией: быстрое определение паттернов метилирования и других химических модификаций нуклеотидов в организме. Как было установлено исследованиями последних лет, такие изменения, называемые эпигенетическими модификациями, обеспечивают передачу большого потока наследственной информации в дополнение к кодируемому последовательностью четырёх нуклеотидов и способны вызывать некоторые болезни, в частности рак, диабет и пагубные зависимости. Новый датчик позволит своевременно выявить предрасположенность к этим заболеваниям.
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru
28.03.2012