Реликтовые микроорганизмы криолитозоны как возможные объекты геронтологии
Оригинал очень-очень научной статьи, разобранной по косточкам в другой статье,
совсем не научной, о чем можно догадаться по подписи автора – Здоровый Скептик,
Микробиологический анализ Мамонтовой горы: опыт журналистского расследования
Тюменский научный центр СО РАН
Исследование клеток, способных выживать на протяжении многих тысячелетий может представлять интерес для геронтологии.
Брушков А.В. (1), Грива Г.И. (2), Мельников В.П. (2), Суховей Ю.Г. (2), Репин В.Е. (3), Каленова Л.Ф. (2), Бреннер Е.В. (3), Субботин А.М. (2), Трофимова Ю.М. (1), Танака М. (4), Катаяма Т. (4), Утсуми М (4).
1 - Тюменский государственній нефтегазовый университет; 2 - Тюменский научный центр СО РАН; 3 - Инстиут химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; 4 - Hokkaido University; 5 Institute of Agricultural and Forest Engineering, University of Tsukuba
ВВЕДЕНИЕ
В условиях, когда изучение механизмов старения по-прежнему представляют собой актуальную фундаментальную проблему, исследование клеток, способных выживать на протяжении многих тысячелетий, вполне может представлять интерес для геронтологии. Сама по себе находка реликтовых живых клеток представляет собой исключительное событие. Считалось, что бактерии, являясь, по сути, упрощенными подобиями клеток эукариот, живут или сохраняют жизнеспособность долго. Однако подтверждения этому нашлись лишь недавно. Показано, что споры сибирской язвы сохраняются около 105 лет (Puskeppeleit и др., 1992). Выращены колонии бактерий, которые были извлечены из янтаря возрастом 40 миллионов и более лет (Greenblatt и др, 1999). Однако перечисленные находки не позволяют так утвердиться в мысли о феноменальной продолжительности жизни бактерий, как это сделали исследования вечной мерзлоты. Территория вечной мерзлоты велика (рис. 1), только в Российской Федерации она занимает около 70% площади. Она имеет температуры, в основном, около -2 - -8ºС, а ее возраст составляет местами миллионы лет.
Рис. 1. Область распространения многолетнемерзлых пород в Северном полушарии
Свидетельства жизнеспособности микроорганизмов в мерзлоте появились еще в девятнадцатом столетии. В 1979 году на Антарктической станции Восток обнаружены бактерии, грибы, диатомеи и другие микроорганизмы (Абызов и и др., 1979). Цианобактерии были найдены в Антарктиде на глубине 3600 метров, их возраст составляет около 500 тысяч лет. Метаболизм бактерий в вечной мерзлоте был отмечен при температурах около -20°C (Friedmann, 1994). Бактериальное сообщество было найдено в Антарктической вечной мерзлоте (Hubbard и др., 1968). Имеются некоторые другие факты относительно роста бактерий ниже 0°C (Forster, 1887; Лозина-Лозинский, 1972; Flanagan, Veum, 1974; Bunt, Lee, 1970; Morita, 1975; Kalinina и др., 1995; Clein, Schimel, 1995). Микроорганизмы отличаются устойчивостью к замораживанию; многие из них его легко переносят (Psenner, Sattler, 1998). Известно, что при температурах ниже -20°С часть воды в тканях (свыше 10%) остается незамерзшей (Брушков и др., 1995). Не отрицая вероятности развития микроорганизмов в мерзлых породах, отметим, что их рост затруднен. Даже в лабораторных условиях стареющие культуры, как известно, прекращают расти. Кристаллизация воды и остановка внешнего обмена веществ уменьшает способность к росту. Толщина прослоев незамерзшей воды при температурах - 2 и - 4°С составляет приблизительно 0.01 - 0.1 микрон, то есть значительно меньше, чем размеры микроорганизмов, которые составляют 0.3 - 1.4 микрон и более. Эти проводящие пути практически непригодны для жизнеобеспечения, а о заметном переносе клеток в таком материале не может быть и речи. Поэтому можно быть уверенными, что бактерии в многолетнемерзлых породах представляют собой ископаемые, реликтовые организмы. Их возраст подтверждается геологическими условиями местонахождения, историей формирования мерзлых толщ, радиоуглеродными датировками, результатами изучения оптических изомеров аминокислот и, косвенно, биоразнообразием встреченных видов.
Природа длительной жизнеспособности микроорганизмов в древней мерзлоте не имеет исчерпывающего объяснения. Имеется мнение, основанное на экспериментах, что в организме в состоянии анабиоза не происходит никаких химических и биологических реакций (Hinton, 1968). Однако большинство белков в живой клетке, как известно, не стабильно (Александров, 1985) и живут минуты и реже дни. Генетические структуры подвержены мутациям (Cairns и др., 1988), а репаративные механизмы не столь эффективны, чтобы не допускать накопления повреждений. На клеточные структуры действуют свободные радикалы и радиация. Тепловое движение атомов и молекул в водном растворе является очевидным разрушающим фактором - температуры мерзлоты далеки от абсолютного нуля. Цитоплазма клетки при этом не замерзает (Low temperature..., 1968), вероятно, она не замерзает вообще (Kanwisher, 1955). Можно предположить, что организм и в анабиозе подвержен разрушению и распаду. Так, данные по тепловой стабильности нуклеотидов (Levy, Miller, 1998) показывают, что из-за неустойчивости цитозина время, в течение которого цепь ДНК способна к передачи информации, едва ли превышает несколько сот лет. Если принять в расчет среднюю скорость мутаций, за тысячу лет в бактериальной хромосоме едва ли не каждый ген подвергнется изменению, а в течение миллиона лет от генетического аппрарата, даже при условии функционирования репарационных систем, не останется «ничего живого». Это подтверждают исследования древней ДНК мумий, мамонтов, насекомых в янтаре и других организмов, которая оказывается фрагментированной и частично разрушенной Greenblatt и др., 1999). Расчеты показывают, что даже небольшие фрагменты ДНК (100–500 нуклеотидов) могут сохраниться не более 10000 лет в обычном климате и максимум до 100000 лет в холодных районах из-за гидролиза. Таким образом, представляется неясным, как бактерии выживают в тысячелетней мерзлоте. Способность реликтовых микроорганизмов сохранять жизнеспособность длительное время предполагает существование механизмов, предотвращающих накопление повреждений. Нам представлялось целесообразным изучить влияние этих микроорганизмов на высшие организмы, тем более, что и иммунные реакции последних могут представлять интерес.
В настоящей работе описаны бактерии, найденные в древних мерзлых толщах Якутии, и приведены предварительные результаты тестирования биологической активности их культуры на дрозофилах и лабораторных мышах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
Для исследования микроорганизмов в мерзлых породах были отобраны образцы из обнажений и подземных сооружений в нескольких районах. Одно из них расположено на левом берегу Алдана, в 325 километрах вверх по течению от его впадения в Лену, на Мамонтовой горе. Образцы были отобраны в 0.9-1 м глубже слоя сезонного оттаивания. Обнажение разрушается рекой (более метра в год), так что отложения, из которых отбирались образцы, находились, очевидно, в многолетнемерзлом состоянии. При этом происходит ежегодное весенние смывание обрушений, предотвращающее завалы и смешения пород. Последние представляют собой тонкозернистые пески и алевролиты; их возраст соответствует среднему миоцену и составляет 10-12 млн. лет (Баранова и др., 1976). Похолодание и связанное с ним промерзание отложений началось здесь в конце плиоцена, около 3 - 3.5 миллионов лет тому назад. В более поздние этапы геологического развития отложения не оттаивали из-за холодного климата Якутии. По данным палеоклиматических реконструкций региона среднегодовые температуры в плейстоцене составляли от -12 до -32°C в зимний период времени и от +12 до +16°C (Бакулина, Спектор, 2000). Таким образом, возраст мерзлоты на Мамонтовой горе может достигать 3.5 миллионов лет. Кроме описанного обнажения, образцы для микробиологических исследований отобраны из более молодых повторно-жильных льдов ледяного комплекса Якутии, из стенок подземелья Института Мерзлотоведения им. П.И.Мельникова в Якутске, а также из подземных льдов в тоннеле Фокс и на золотом руднике вблизи Фербенкса на Аляске.
Пробы мерзлых пород отбирались с максимально возможными для полевых условий предосторожностями. Использовались стерилизованные спиртом и обожженные в пламени металлические инструменты (буры, пинцеты, скальпели). Для поверхностной стерилизации образцов проба весом около 50 г помещалась в стакан с 96% раствором этанола, затем в пламя горелки и упаковывалась в стерильную пробирку. Кроме того, отбирались монолиты мерзлых пород весом 4-5 кг. Отобранные породы хранились при температуре -5°C, что было близко к естественным условиям. Транспортировка проб осуществлялась в термоконтейнерах с хладагентами в мерзлом состоянии.
Образцы различного разведения в стерильных условиях добавлялись в чашки Петри, содержащие среды YPD, MRS и NA (Manual of enviromental microbiology, 1997). Образцы добавлялись также в жидкий мясо-пептонный бульон в анаэробных и аэробных условиях.
Рибосомальная ДНК микробной культуры извлекалась с помощью Fast DNA kit for soil (BIO 101 Inc., Vista, CA), где применяется метод, основанный на разрушении клетки стеклянными шариками. Нуклеиновые кислоты осаждались из раствора с использованием раствора, состоящего из 0.1 части 3M ацетата натрия (pH 5.2) и 2.5 частей этанола, инкубировались на льду, а затем центрифугировались в течение 30 минут на скорости 12,000 об/мин. Осажденные нуклеиновые кислоты растворялись затем в дистиллированной воде (свободной от RN-аз и DN-аз), и хранились при -20°C. Фрагменты 16S rRNA были амплифицированы полимеразной цепной реакцией (ПЦР), проводимой с бактериальными праймерами (27F; 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', 1492R; 5’-TGACTGACTGAGGYTACCTTGTTACGACTT-3’). ПЦР проводилась в обьеме 20-µl с помощью GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) следующим образом: 4 мин при 94°C, затем 30 циклов по 1 мин при 94°C, 1 мин при 50°C, и 1.5 мин при 72°C, затем 7 мин при 72°C. ПЦР ампликоны подвергались электрофорезу и очищению с помощью Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Madison, USA). Очищенные ампликоны были клонированы с использованием pCR2.1 вектора, культуры E. coli, а также TA cloning kit (Invitrogen) в соответствии с рекомендациями производителя. Из суточной культуры ДНК плазмид, содержащая 16S rDNA, получена с помощью Mini prep spin kit (Quiagen, Crawley, UK). Очищенные ДНК плазмид секвенировали на ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer с помощью Big Dye Terminator cycle-sequencing kit (Applied Biosystems). Амплицицированные продукты 27F-1492R были секвенированы в обоих направлениях с праймерами 27F, 357F (5'-CTACGGGAGGCAGCAG -3'), 520R (5'-ACCGCGGGGTGCTGGC-3'), 920F (5'-AAACTCAAAGGAATTGACGG-3'), 1080R (5'-CCCAACATCTCACGAC-3') и 1492R как описано (Mori и др., 1997). Длина последовательности составила 1488 bp. Полученная последовательность сравнивалась с другими, используя BLAST (Altschul и др., 1997). Филогенетическое дерево строилось по методу Saitou и Nei (1987), используя CLUSTAL W software package (Thompson и др., 1994). Нуклеотидная последовательность 16S rRNA была депонирована в DDBJ/EMBL/GeneBank под номером AB178889, идентификационный номер 20040510203204.24251.
РЕЗУЛЬТАТЫ ВЫДЕЛЕНИЯ, ИЗУЧЕНИЯ РОСТА И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ
В мерзлых миоценовых отложениях на Мамонтовой горе было обнаружена культивируемая бактерия, способная к аэробному и анаэробному росту в средах YPD, MRS и NA; оптимальная температура роста определена в +37°C. Микроорганизм является психротолерантным, т.к. способен к метаболической активности при -5°C. Бацилла представляет собой сравнительно большую (1-1.5 х 3-6 микрон) палочку, которая в культуре соединяется в цепи (рис.2) и способна образовывать споры круглой формы. Она неподвижна и обладает гемолитической активностью, грамположительна. При температуре -5°С бацилла медленно (признаки роста обнаруживались через 2-3 месяца) росла как в замороженной, так и в переохлажденной среде. Микроорганизм принадлежит роду Bacillus, но, по-видимому, является новым видом. Наибольшее видовое подобие выделенной бациллы отмечено с Bacillus simplex, B. macroides, гомология с 16S rRNA которых состаляет 96-97%.
Рис. 2. Выделенный штамм Bacillus sp.: а) окрашивание по Граму, б) рост при температуре -4°С в течение 5 месяцев
Рост бацилл при низких температурах наблюдался ранее (Ashcroft, 2000). Известно, например, что Bacillus anthracis легко переносит замораживание (Luyet, Gehenio, 1940). Однако, оптимальная температура роста найденной бациллы довольно высока. Несмотря на то, что она оказалась способной на искусственной среде расти и при температуре ниже 0°С, видимых колоний на мерзлых образцах при этом не наблюдалось. Споры бацилл известны как наиболее резистентные (Nicholson и др., 2000); так, B. thuringiensis and B. macroides были найдены в янтаре с абсолютным возрастом 120 миллионов лет (Greenblatt и др., 1999). Поэтому находка живой балиллы в древней мерзлоте Мамонтовой горы в целом не удивительна. Представляет интерес, что в описанном случае наибольшее подобие отмечено именно с видом B. macroides. Насколько активна ее жизнь в мерзлоте, однако, неясно; это относится также и к микроорганизмам, выделенным из льдов Центральной Якутии и Аляски.
Из повторно-жильных льдов Якутии и Аляски возрастом около 25 - 40 тысяч лет по описанной выше методике Т.Катаямой (Katayama и др., 2007) было выделено несколько видов микроорганизмов. Большинство из выделенных бактерий грамположительны и близки к Arthrobacter and Micrococcus spp., а грибы - к Geomyces sp. Многие изоляты оказались способны к росту при -5°С, но не росли при +30°С, т.е. являлись облигатными психрофилами. Интересно, что ДНК метаногенов нескольких групп была также обнаружена и идентифицирована в аллювиальных мерзлых отложениях Якутии. Их исследование не закончено и пока не ясно, имеем ли мы дело с живыми метаногенами. Однако инкубация этих многолетнемерзлых отложений принесла положительные результаты: наблюдалась эмиссия метана при -5°С. Исследования метаногенов представляются перспективными, посольку они могут оказаться ответственными за большое содержание метана в многолетнемерзлых отложениях.
В подземелье Института Мерзлотоведения им. П.А.Мельникова, на глубине около 7 метров на стенах найден белый грибной мицеллий. Похожий мицелий наблюдается и на стенках тоннеля Фокс на Аляске. Идентификация выделенного вида (штамм PF), выполненная М.Танакой, была основана на его морфологических характеристиках и анализе последовательности нуклеотидов, амплифированной 18S rRNA. Данный гриб близок к Penicillium еchinulatum и, возможно, представляет собой новый вид. Образцы из мерзлых отложений были подготовлены вместе с образцами штаммов P. echinulatum, полученных из банка культур, и инкубированы при температурах 25°C, 5°C и -5°C. Характеристики прорастания спор и роста штамма PF из мерзлых отложений и штаммов IFO 7760 and IFO 7753 P. echinulatum при более низких температурах оказались различными: штамм PF сравнительно быстро рос при -5°С. Интересно, что при -5°C выделенный штамм рос в чашках Петри, как в тех, где произошла кристаллизация среды, так и в переохлажденной среде (картофельном агаре). При этом на кристаллизованной среде он рос быстрее (рис.3). Выделенный штамм Penicillium еchinulatum в подземелье Института Мерзлотоведения им. П.И.Мельникова в Якутске, несмотря на его адаптацию к холоду и условиям питания, вполне может быть современным, занесенным с поверхности. Кроме того, этот гриб растет только в аэробных условиях. Поэтому и его способность к росту внутри древней мерзлоты сомнительна.
ПРИРОДА ДЛИТЕЛЬНОЙ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ
Молекулярные основы тепловой стабильности биологических материалов представляют собой нерешенную проблему (Baker, Agard, 1994; Jaenicke, 1996; Levy, Miller, 1998). В целом, стабильность белка определяется величиной свободной энергии, G, для реакции "свернутая - развернутая структура" при физиологических условиях. Большинство белков характеризуются значением G = 5 - 15 ккал/моль (Александров, 1975). Доля разрушенных областей структуры, отнесенная к доле упорядоченных областей (k) представляется следующей:
где: G - свободная энергии перехода от упорядоченной области к случайной, ккал/моль;
T - температура, °K;
R - газовая константа, ~0,001989, ккал/моль*°К.
Рис. 3. Результаты исследований стабильности нуклеотидов. Период полураспада цитозина при температурах 0 - -10 градусов Цельсия около 300 лет составляет около 350 лет
(по данным Levy, Miller, 1998)
Это выражение может быть использовано для приблизительной оценки времени жизни биологических молекул. При этом оказывается, что для G = 30 ккал/моль время существования связей составляет около 300 лет. Для периода температурных колебаний молекул 10-8 - 10-9 секунды и G = 20 ккал/моль время их существования - менее года. Максимальное известное значение энергии активации - приблизительно 45 ккал/моль; обычно - меньше (Александров, 1975). Приведенные оценки очень приблизительны, но и они показывают, насколько нестабильны белки и ДНК. Данные по тепловой неустойчивости цитозина приведены в работе М. Леви и С. Миллера (Levy, Miller, 1998, рис. 3). Интересны в этом смысле наши данные по времени жизни наиболее устойчивого среди вирусов вируса натуральной оспы. Показано, что оно совпадает с приведенными расчетными данными и составляет несколько сотен лет (Repin и др, 2000). В отличие от вирусов бактерии - живые объекты. Они способны к метаболической активности и без наличия питательных веществ в среде, и при низких температурах (Repin и др., 2007). Эволюционно значимые преобразования отмечены для неделящихся культур (Cairns и др, 1988). Особый интерес, конечно, представляют микроорганизмы, сохраняющиеся в природных условиях при низких температурах протяженные временные периоды (Репин и др., 2007; Greenblatt и др., 1999). Прослеживается возможность комбинаторных преобразований, предсказанных ранее (Заварзин, 1979). Нельзя не отметить в этом аспекте о существовании таких биокатализаторов, как рибозимы, активность которых связывают с происхождением жизни и миром РНК (Lutay и др. 2007). В нашем случае может оказаться важно, что рибозимы стабильны и активны при температуре ниже 0°С. Большое разнообразие реликтовых микроорганизмов, выделенных из ледяной жилы возрастом 25-40 тысяч лет, возможно, объясняется кодированием свойства длительной жизнеспособности мобильными генетическими структурами типа плазмид.
Таким образом, длительное существование живых микроорганизмов трудно объяснить замедлением жизнедеятельности при анабиозе. По всей видимости, оно обусловлено наличием уникальных репарационных механизмов, поддерживающих клеточные структуры.
ТЕСТИРОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ БАЦИЛЛ НА ВЫСШИХ ОРГАНИЗМАХ
Тестирование на мушках Drosophila melanogaster
Для эксперимента отбирались особи Drosophila melanogaster одного возраста (1 сутки). Их помещали в пробирки с питательной средой (5-7 мл) по 5 пар. Объем выборки для каждого варианта составил 100 мух. Отбор особей для эксперимента проводили путем эфиризации, погибших и выживших мух учитывали каждые третьи сутки. Эксперимент проводили с суточной культурой Bacillus sp., штамм 3М, выращенной на мясопептонном бульоне. В опытную пробирку вносили культуру в объёме 20 мкл. Эксперимент включал контрольный вариант, в котором мух содержали на среде с добавлением дрожжей; и опытный вариант, когда первые 5 суток мух содержали на среде с добавлением дрожжей, затем 1 сутки на среде с бациллой (чередование весь период наблюдения). Для определения плодовитости отбирались виргинные мухи в день вылета. Самок и самцов помещали отдельно и выдерживали 5 суток по достижении ими максимальной плодовитости. Затем помещали попарно в пробирки со съемными крышками. Дно крышек заливали агар-агаром кондитерским с добавлением сахара. Учет плодовитости проводили ежесуточно на протяжении 6 дней. Учитывали количество отложенных яиц, а через сутки определяли количество неразвившихся яиц.
При добавлении на поверхность питательной среды 75 мкл штамма 3М в физрастворе (1млрд. кл/мл) наблюдалось снижение плодовитости по отношению к контролю в 5 раз. Средняя плодовитость самки составила в контроле 58,1±8,61 шт., в опытном варианте эта величина 10,2±3,44 шт. В другом эксперименте испытана жидкая культура штамма 3М в мясопептонном бульоне, возраст культуры 1 сутки. В качестве контроля использовали чистый мясопептонный бульон. Низкую плодовитость наблюдали в обоих вариантах (в контроле – 8,1±0,82 шт., в опыте - 20,5±3,30 шт.).
При добавлении бактериальной культуры после выдерживания мушек на дрожжях, несмотря на гибель мушек в опыте и контроле после 50 дней, отмечалось превышение доли выживших мух с 24-х по 42-е сутки эксперимента по сравнению с контролем (рис. 4).
Рис . 4. Влияние культуры Bacillus sp., штамм 3М, на продолжительность жизни Drosophila melanogaster
Тестирование на лабораторных мышах
Подготовка бактериальной культуры проводилась аналогично методике тестирования на дрозофилах; использовалась суточная культура Bacillus sp., штамм 3М, однако перед введением проводили ее замораживание и оттаивание. Эксперименты проводились на мышах F1 CBA/Black-6, в среднем по 15 особей в каждой группе. В первой серии экспериментов изучалось влияние доз культуры на параметры иммунной системы молодых животных (возраст 3-4 месяца). В контроле использовали две группы животных, одна из которых была интактной, а второй группе вводили физиологический раствор. Бактериальную культуру вводили животным однократно внутрибрюшинно 5 000 (1); 50 000 (2); 500 000 (3); 5 000 000 (4) и 50 000 000 (5) микробных тел (м.т.) на животное. Во второй серии экспериментов оценивалось влияние бактериальной культуры на физиологические и поведенческие реакции «пожилых» мышей (возраст 17 месяцев), при этом культуру вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 5000 м.т. Контрольная группа была представлена животными того же возраста. Эвтаназия животных проводилась методом дислокации шейных позвонков. По стандартным методикам оценивались морфофизиологическая активность тимуса и селезенки по индексу органа (отношение веса органа к весу тела, %), активность факторов неспецифической иммунорезистентности по уровню фагоцитарной (ФП, %) и метаболической (НСТ-тест, %) активности селезеночных макрофагов, клеточного иммунитета в реакции ГЗТ in vivo по Crowle (1975), активность гуморального иммунитета по числу антителообразующих клеток (АОК) в 1 миллионе ядросодержащих клеток в селезенке по Cunningham (1968), мышечная сила животных в тесте поднятия груза (Островский М.М., 1970), поведенческие реакции в тесте «Открытое поле» (Буреш Я. и соавт., 1991), продолжительность жизни, а также другие показатели.
Оказалось, что доза бацилл Bacillus sp., штамм 3М в 5 000 микробных тел способствует увеличению индексов тимуса и селезенки (рис. 5).
Рис . 5. Влияние культуры Bacillus sp., штамм 3М при парентеральном введении различного количества клеток на индексы тимуса и селезенки лабораторных мышей 3-х месячного возраста
Культура бацилл в малой дозе (5000 м.т.) стимулируют, а в средних дозах (500000 и 5000000 м.т.) – подавляют фагоцитарную активность селезеночных макрофагов. Культура бацилл почти во всех дозах повышает активность гуморального иммунитета, а доза в 5000 м.т. способствует увеличению функциональной активности и клеточного и гуморального иммунитета.
В этой связи для исследований влияния культуры на продолжительность жизни была выбрана доза в 5 000 м.т..Минимальный срок жизни мышей из контрольной группы составил 589 дней, а максимальный - 833 дня. Минимальный срок жизни мышей из опытной группы составил 836 дней, а максимальные – 897 (рис. 6).
Рис . 6. Влияние культуры Bacillus sp., штамм 3М при парентеральном введении 5000 клеток на продолжительность жизни лабораторных мышей 17-ти месячного возраста
Вес тела у животных опытной группы был выше, чем у животных контрольной группы через 2 месяца после введения культуры. Мышечная сила у опытных животных увеличилась (около 60%) относительно сверстников из контрольной группы. О повышении у животных способности к ориентации в пространстве и исследовательской активности свидетельствовало более частое посещение ими внутренних секторов открытого поля, увеличение числа вертикальных стоек и посещения норок. По-видимому, бактериальная культура при парентеральном введении стимулирует иммунную систему и улучшает эмоциональную устойчивость лабораторных животных. Увеличение продолжительности жизни мышей свидельствует о возможном присутствии в бактериальной культуре Bacillus sp. геропротекторов
Следует подчеркнуть, что исследования свойств культур реликтовых микроорганизмов следует считать весьма предварительными как с точки зрения их объема, так и постановки. Очевидно, что способность микроорганизмов из вечной мерзлоты к сохранению жизнеспособности в течение тысяч и миллионов лет едва ли может быть перенесена или использована без понимания ее механизма. Важно заметить, что подобная задача имеет не только фундаментальный характер, но и в перспективе исключительное прикладное значение.
ВЫВОДЫ
1. Выделение и идентификация реликтовых микроорганизмов из вечной мерзлоты представляет собой самостоятельную задачу как для микробной экологии, так и систематики в связи с содержанием новых видов. Природа их длительной жизнеспособности в течение тысяч и миллионов лет в мерзлоте при температурах около -2 - -8ºС нуждается в исследовании.
2. Выделенный из вечной мерзлоты Мамонтовой горы, возраст которой достигает около 3.5 миллионов лет, и идентифицированный по 16S rDNA штамм 3М Bacillus sp. относится к группе психротолерантных микроорганизмов и обладает высокой резистентностью к неблагоприятным факторам природной среды. Для мерзлоты более молодого возраста (25-40 тысяч лет) характерно содержание большой группы микроорганизмов, в том числе грибов.
3. Снижение в отдельных экспериментах смертности мух Drosophila melanogaster, а также лабораторных мышей в сочетании со стимуляцией иммунной системы и улучшением физического состояния последних позволяет считать перспективными исследования реликтовых микроорганизмов в геронтологии.о превалировании активности груминга.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Altschul S. F., Madden T. L., Schaffer A. A., Zhang J. H., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. 1997 Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402.
Ashcroft F. 2000. Life at the Extremes. HarperCollins. 326p.
Baker D., Agard D., 1994. Kinetics versus thermodynamics in protein folding. Biochemistry, 33, 750509.
Bunt J.S., Lee C.C., 1970. Seasonal primary production in Antarctic sea ice at McMurdo Sound in 1967, J. Mar. Res., 28: 304-320.
Cairns J. Overbaugh J., Miller S., 1988. The origin of mutations// Nature, 335, P.142-145
Clein J.S., Schimel J.P., 1995. Microbial activity of tundra and taiga soils at sub-zero temperatures. Soil Biol. Biochem. 27: 1231-1234.
Flanagan P.W., Veum A.K., 1974. Relationships between respiration, weight loss, temperature and moisture in organic residues on tundra. In: Soil Organisms and Decomposition in Tundra (Eds A.J.Holding, O.M.Heal, S.F.Maclean, Jr. and P.W.Flanagan), pp. 249-277, Swedish IBP Committee, Stockholm.
Forster J., 1887. Ueber einige Eigenschaften Leuchtender Bakterien, Cent, Bacteriol. Parasitenk., 2:337-340.
Friedmann E.I. 1994. Permafrost as microbial habitat. In Viable Microorganisms in Permafrost. Russian Academy of Sciences: Pushchino, Russia; 21-26.
Greenblatt CL, Davis A, Clement BG, Kitts CL, Cox T, Cano RJ. 1999. Diversity of Microorganisms isolated from amber. Microbial Ecology 38: 58-68.
Hinton H.E., 1968. Reversible suspension of metabolism and the origin of life. Proc. Roy. Soc. Ser. B, vol. 171, pp. 43-56.
Hubbard J.S., Cameron R.E., Miller A.V., 1968. Soil studies – desert microflora. XV. Analysis of Antarctic dry valley soils by cultural and radiorespirometric methods, Space Prog. Summary No. 37-52, 3, pp. 172-175.
Jaenicke R., 1996. Stability and Folding of Ultrastable Proteins: Eye Lens Crystallins and Enzymes from Thermophiles. FASEB J., 10, 84-92
Kalinina L.V., J.G. Holt and J.J. McGrath. 1994. Identity of bacterial from Siberian permafrost soils. In IUMS Congresses '94; 7th International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology Division; 7th International Congress of Mycology Division, Prague, Czech Republic, July 3-8, 1994.
Kanwisher J., 1955. Freezing in intertidal animals. Biol. Bull., 109: 56-63.
Katayama Т., M. Tanaka, J. Moriizumi, T.Nakamura, A.Brouchkov, T.Douglas, M.Fukuda, F.Tomita, and K.Asano Phylogenetic Analysis of Bacteria Preserved in a Permafrost Ice Wedge for 25,000 Years. Appl. Environ. Microbiol., Apr. 2007: 2360-2363
Levy M., Miller S.L., 1998. The stability of the RNA bases: Implications for the origin of life. Biochemistry 95 (14): 7933-7938
Low temperature biology of foodstuffs. 1968. In The proceedings of a NATO Advanced Study Institute held at the University of Strathclyde, Hawthorn J, Rolfe EJ (ed.). Pergamon: Oxford; 458 p.
Lutay A.V., Zenkova M.A., Vlassov V.V. 2007. RNA World: First Steps Towards Functional Molecules.//In book:"Biosphere Origin and Evolution". Eds. N. Dobretsov, N. Kolchanov, A. Rozanov and G. Zavarzin, Springer, P. 127-138.
Luyet B.J., Gehenio P.M. 1940. Life and death at low temperatures. Biodynamica: Normany, Missouri; 99 p.
Manual of environmental microbiology. 1997. Ed. Hurst C.J. FSM Press. Washington DC. 894 p.
Mori K., Yamazaki K., Ishiyama T., Katsumata M., Kobayashi K., Kawai Y., Inoue N., Shimamo H. 1997. Comparative sequence analyses of the genes coding for 16S rRNA of Lactobacillus casei-related taxa. Int.J.Syst. Bacteriol. 47:54-57.
Morita R.Y. 1975. Psychrophilic bacteria. Bacteriol. Rew. 39: 144-167
Nicholson W.L., Munakata N., Horneck G., Melosh H.J., Setlow P. 2000. Resistance of Bacillus endospores to extreme terrestrial and extraterrestrial environments. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64:548-572.
Psenner R., Sattler B. 1998. Life at the freezing point. Science 280:2073-2074
Puskeppeleit M., Quintern L.E., Naggar S., Schott J.U., Eschweiler U., Horneck G., Bücker H. 1992. Long-term dosimetry of solar UV radiation in Antarctica with spores of Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 58:2355-2359
Repin V., Gus'kov A.A., Belanov E.F., Sokunova E.B., Marennikova S.S., and Sandakhchiev L.S. 2000. Permafrost as a potential source for replenishing collections with pathogenic microorganisms// Hydrological Science and Technology.V.16, N.1-4., P.35-39
Repin V.E., Pugachev V.G., Taranov O.S., Totmenina O.D., Belikov S.I., Oreshkova S.F., Andreeva I.S., Puchkova L.I., Emelianova E.K., Riabchikova E.I., Mokeeva A., Argunov V.A., Chernyavsky V.F., Nikiforov O.I., Sofronova O.N. 2007. Biodiversity of microorganisms isolated from brain of the Yukagir mammoth// in book: “Yukagir mammoth”, eds. G.G.Boeskorov, A.N.Tikhonov, N.Suzuki.- Saint Petersburg: Saint Petersburg University Publishing House, P.177-182
Thompson J. D., Higgins D. G., Gibson T. J. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res., 22, 4673-4680.
Абызов С.С., Бобин Н.Е., Кудряшов Б.Б., 1979. Микробиологические исследования ледника в Центральной Антарктиде. Известия АН СССР, серия биология, 6, с. 828-836.
Александров В.Я. 1975. Клетки, макромолекулы и температура. Ленинград, Изд-во Наука.
Бакулина Н.Т., Спектор В.Б. 2000. Реконструкция климатических параметров неогена Якутии по палинологическим данным. В кн.: Климат и мерзлота. Г.Н. Максимов и А.Н.Федоров (ред.). Институт мерзлотоведения, Якутск. С. 21 - 32.
Баранова Ю.П., Ильинская И.А., Никитин В.П., Пнева Г.Н., Фрадкина А.Ф., Шварева Н.Я. Миоцен Мамонтовой горы. Труды ГИН СО АН СССР. Наука. Москва. 1976. 284 с.
Брушков А.В., Власов А.Н., Мерзляков В.П., Талонов А.В. Влияние локальных фазовых переходов на деформируемость пластично-мёрзлых грунтов. Ж-л «Геоэкология. Инженерная геология, гидрогеология, геокриология», 1995. № 5. С.71-77.
Заварзин Г.А. 1979. Пространство логических возможностей в многообразии бактерий и их филогения. Природа, №6, С.9-19
Лозина-Лозинский Л.К. Очерки по криобиологии. Л., Наука, 1972. 288с.
Репин В.Е., Пугачев В.Г., Таранов О.С., Тотменина О.Д., Беликов С.И., Орешкова С.Ф., Пучкова Л.И., Аргунов В.А., Чернявский В.Ф., Никифоров О.И., Софронова О.Н. 2007.Потенциальная опасность микроорганизмов, пришедших из прошлого// в книге: Юкагирский мамонт, ред. Г.Г.Боескоров, А.Н.Тихонов, Н.Сузуки.-СПб.: С.-Петерб. ун-та, С.183-190
БЛАГОДАРНОСТИ АВТОРОВ
Мы благодарны академику В.В.Власову (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН), профессору В.Н.Анисимову (Институт онкологии им. Петрова) и проф. П.Вильямсу (Scott Polar Research Institute, Cambridge, UK) за поддержку настоящей работы и полезные дискуссии, служащим Министерства экологии Республики Саха-Якутия за помощь в полевой работе, а также сотрудникам Hokkaido University и Tsukuba University, Japan за содействие в микробиологических исследованиях.