Эмбриональные стволовые клетки – лекарство от старости (4)
(Продолжение. Начало статьи – здесь.)
IV. СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
И ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ РЕШЕНИЯ
Методы клеточной терапии, подразумевающие использование чЭСК, в настоящее время находятся на стадии развития и только начинают проходить тестирование в рамках клинических исследований. Для разработки комплекса оптимальных методов и принципов консервации, тестирования и распределения чЭСК для последующего клинического применения Международным форумом по стволовым клеткам (группа американских и международных организаций, финансирующих исследования стволовых клеток) была создана Международная инициатива по консервации стволовых клеток (ISCBI) [74]. В США Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) также осуществляет мониторинг разрабатываемых руководств и сформулировало рекомендации для экспертов, рассматривающих предложения по проведению клинических исследований с использованием стволовых клеток [75]. Важно отметить, что данные рекомендации не обеспечивают ни качества, ни эффективности полученных из чЭСК клеток, используемых в клинической практике. Вместо этого рекомендации гарантируют, что используемые в терапии клетки способны к воспроизведению и соответствуют особым критериям, обеспечивающим безопасность пациентов (табл. 2). Основные вопросы безопасности, связанные с использованием чЭСК, описаны в следующих разделах.
A. Культивирование без использования ксенобиотиков
Большинство используемых в настоящее время линий чЭСК в процессе выделения и культивирования in vitro подвергалось воздействию продуктов животного происхождения. В таких условиях чЭСК могут инфицироваться вирусами животных и другими неизвестными субстанциями, способными вызывать в организме реципиента развитие губительных иммунных реакций. В настоящее время, согласно жестким требованиям ISCBI, линии чЭСК, создаваемые для клинического использования, проходят интенсивное микробиологическое тестирование. FDA официально требует предоставления документов, содержащих информацию об источнике, а также о возможном содержании генетически модифицированных компонентов и патогенных агентов в каждой линии чЭСК, предназначенной для клинического использования. Таким образом, в настоящее время предпринимаются усилия, направленные на устранение возможного воздействия ксенобиотиков. Недавно были разработаны заменители питательных сред, позволяющие культивировать чЭСК в условиях, не содержащих ксенобиотиков. К ним относятся не содержащие ксенобиотиков заменители сыворотки, такие как Knockout Serum Replacer (Invitrogen), и не содержащие ксенобиотиков культуральные среды, такие как HESGRO (Millipore) и TeSR (STEMCELL).
В настоящее время для снижения риска загрязнения чужеродными агентами при культивировании чЭСК на фидерных слоях клеток ведется разработка бесфидерных систем культивирования. На сегодняшний день на рынке уже представлены не требующие использования фидерных слоев и не содержащие ксенобиотиков среды для культивирования, представляющие собой смеси рекомбинантных факторов, способных подавлять дифференцировку и сохранять чЭСК в плюрипотентном состоянии. Однако в некоторых публикациях есть данные, согласно которым отказ от фидерных слоев при культивировании чЭСК ассоциирован с увеличением нестабильности хромосом и повышением риска размножения генетически измененных клеток [76]. По этой причине большинство работающих с чЭСК лабораторий практикуют программу контроля стабильности генома культивируемых клеточных линий [28, 49].
Были также опубликованы данные о создании линий чЭСК с использованием человеческих фидерных клеток. Например, линии чЭСК были успешно получены на подложке из человеческий фибробластов, выделенных из крайней плоти новорожденного [77, 78] и фибробластов кожи взрослого [79]. Некоторые занимающиеся созданием новых клеточных линий лаборатории полностью перешли на использование не содержащих ксенобиотиков условий культивирования [80]. Возможность выделять и поддерживать новые линии чЭСК с использованием фидерного слоя из фибробластов человека является значительным достижением на пути к созданию пригодных для клинического применения чЭСК.
B. Генетические аномалии в культурах чЭСК
Наиболее хорошо охарактеризованными линиями чЭСК на сегодняшний день являются линии, выделенные в числе первых. Однако они могут быть не самыми лучшими кандидатами на использование в клинической практике, так как при работе со многими из них применялись продукты животного происхождения. В нескольких линиях чЭСК была зарегистрирована хромосомная и геномная нестабильность, характеризующаяся утратой гетерозиготности или изменениями количества копий генов, ассоциированных с развитием рака [81, 82]. Учитывая то, что данные изменения не регистрировались в клетках ранних пассажей, скорее всего, многие из этих мутаций индуцированы продолжительным культивированием. Было высказано предположение, что такие кариотипические аберрации возникли при адаптации клеток к исходным условиям культивирования, которые использовали при выделении и размножении нескольких первых линий [83]. Эти наблюдения подчеркивают необходимость получения детальных характеристик линий чЭСК, в особенности влияния долгосрочного культивирования, а также создания руководства по оценке характеристик чЭСК, пригодных для клинического использования.
C. Обогащение, направленная дифференцировка и очистка клеток, полученных из чЭСК
Основным вопросом безопасности, связанным с использованием чЭСК, является их способность формировать опухоли, состоящие из зародышевых листков. Как описано выше, in vivo трансплантация недифференцированных чЭСК в мышиные модели приводит к формированию тератом. Свидетельства о формировании тератом также были получены при in vivo трансплантации дифференцированных производных чЭСК [8, 85]. Таким образом, крайне важным моментом является отсутствие онкогенных клеток в производных чЭСК, предназначенных для трансплантации. Еще одной проблемой является возможность дифференцировки полученных из чЭСК клеток в клетки нежелательных типов. Например, встраивание «неправильных» мышечных клеток в поврежденную сердечную мышцу может нарушать электрическую активность ткани миокарда реципиента и вызывать аритмию [86]. Таким образом, разработка и дальнейшая оптимизация протоколов дифференцировки и очистки необходима для минимизации вероятности появления нежелательных типов клеток при проведении доклинических экспериментов по трансплантации и клинической терапии.
Как описано ранее, обогащения популяций специфичных типов клеток можно добиться путем внесения в культуру определенных молекул в критические моменты времени. Однако многие из этих методов обеспечивают только умеренное обогащение, недостаточное для использования клеток в клинической практике. Возможно, целесообразным является обогащение популяции частично дифференцированными пролиферирующими промежуточными производными чЭСК, для которых характерно определенная направленность дифференцировки. Такие клетки впоследствии можно размножать до конечной дифференцировки в необходимые для терапии клетки. Например, экспрессия антигена клеточной поверхности CD133 на пролиферирующих чЭСК свидетельствует о предопределенности их дифференцировки в нейроэктодерму [26]. Выделенные из культур недифференцированных чЭСК CD133-положительные клетки in vitro и in vivo преимущественно демонстрировали дифференцировку в нейроэктодермальные клетки [26].
В отсутствие специфичных поверхностных антигенов, таких как CD133, позволяющих идентифицировать тканеспецифичные клетки-предшественники, для выделения специфичных субпопуляций чЭСК используют молекулярные зонды. King et al. [25] впервые продемонстрировали пригодность этой системы для выделения жизнеспособных плюрипотентных чЭСК, экспрессирующих Oct4, с помощью специфичного высокопроизводительного метода. Молекулярные зонды представляют собой одноцепочечные олигонуклеотиды, испускающие флуоресцентный сигнал при связывании с иРНК-мишенью. Это обеспечивает возможность регистрации и выделения клеток путем метода активируемой флуоресценцией сортировки. Что еще более важно, молекулярные зонды имеют очень короткий срок жизни внутри клетки и не нарушают функционирование и структуру генома чЭСК. Таким образом, данный метод можно использовать для обогащения целевых популяций клеток, полученных из чЭСК, с удалением нежелательных типов клеток, таких как недифференцированные чЭСК, способные формировать опухоли [25].
D. Предотвращение иммунного отторжения трансплантированных клеток, полученных из чЭСК
Трансплантированные чЭСК вызывают развитие реакции иммунного отторжения [87], так как и пролиферирующие, и дифференцированные чЭСК экспрессируют антигены HLA I и II типа, а также второстепенные антигены гистосовместимости в количествах, достаточных для активации иммунной системы [87, 88]. Другой потенциальный барьер для приживления может возникать из-за несовпадения антигенов групп крови системы AB0 на клетках донора и реципиента [89-91]. Хотя исследования по выявлению влияния несовместимости по системе AB0 на успех трансплантации чЭСК до сих пор не проводились, этот показатель давно является критерием успеха трансплантации органов и, соответственно, несовместимость донорских клеток и реципиента по системе AB0, скорее всего, также способна запускать реакцию иммунного отторжения.
Оптимальным методом предотвращения иммунного отторжения является подбор генетически идентичных донорских клеток и реципиента. Поэтому специалисты проявляют интерес к разработке и использованию метода переноса ядер для создания специфичных для пациентов линий чЭСК. При использовании этого метода ДНК, выделенную из клеток кожи или мышц пациента, вводят в неоплодотворенную яйцеклетку, из которой предварительно удаляют собственный генетический материал. После этого яйцеклетку искусственно оплодотворяют и позволяют ей развиваться до достижения стадии бластоцисты, пригодной для извлечения чЭСК. Клетки полученной в результате линии имеют иммунологический профиль, соответствующий иммунологическому профилю пациента и, соответственно, подходят для использования в клеточной терапии. Описанный метод успешно протестировали на животных с использованием видоспецифичных ЭСК, однако получить чЭСК с помощью переноса ядер соматических клеток пока не удалось.
К другим стратегиям создания линий чЭСК, максимально совместимых с потенциальным реципиентом, относятся создание «универсальных донорских чЭСК», клеток с пониженной экспрессией антигенов HLA, несущих антиген группы крови 0, или химерных гемопоэтических клеток, полученных из чЭСК и способных подавлять иммунные реакции при одновременной трансплантации с полученными из чЭСК клетками [92]. В качестве альтернативы рассматривается создание банков линий чЭСК, несущих комбинации антигенов HLA/AB0, подходящие для трансплантации большинству пациентов. Проведен ряд исследований, целью которых была оценка количества линий чЭСК, необходимого для обеспечения потребностей определенной популяции. Taylor et al. [93] подсчитали, что для обеспечения большинства жителей Великобритании совместимыми по системе HLA трансплантатами достаточно примерно 150 линий чЭСК. Как вариант, для обеспечения потребностей большей части популяции можно использовать примерно 10 линий гомозиготных по антигенам HLA чЭСК, полученных в результате партеногенетического оплодотворения. Согласно оценкам Nakajima et al. [94], для обеспечения трансплантатами 80% населения Японии достаточно примерно 170 полноценных линий чЭСК или 55 линий чЭСК, гомозиготных по антигенам HLA. Эти цифры подтверждают целесообразность создания и функционирования банков чЭСК, содержимое которых позволит решить проблему большого количества пациентов. Однако для обеспечения потребностей этнически и генетически разнообразного населения таких стран как США потребуется намного большее количество линий чЭСК. Учитывая этические вопросы и ограничения, применяемые к исследованиям чЭСК, а также небольшое количество существующих на сегодняшний день одобренных линий чЭСК, создание банка, содержащего обширную коллекцию разнообразных линий чЭСК, будет неизменно связано с очень серьезными трудностями.
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru
19.12.2011