Старение и способы продления жизни: берем уроки у дрожжей
Последнее десятилетие существенно повысило уровень понимания процессов старения и вселило в людей оптимизм по поводу скорого появления способов продления жизни. Огромный вклад в этот прогресс сделали обыкновенные пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae, изучение которых прояснило многие вопросы, касающиеся механизмов старения различных организмов, в том числе беспозвоночных и млекопитающих. Кроме того, выявленные в результате этих исследований механизмы стали мишенями наиболее перспективных из разрабатываемых в настоящее время геропротекторов – препаратов против старения.Дрожжи являются одним из наиболее важных модельных организмов, используемых при изучении вопросов старения. Простота работы с дрожжами и их короткий жизненный цикл позволили идентифицировать молекулярные механизмы старения этих организмов и выявить несколько десятков факторов, влияющих на продолжительность их жизни. На сегодняшний день неясно, насколько полученные данные применимы к человеку, однако, несмотря на специфичность ряда аспектов старения дрожжей, многие из наиболее важных механизмов сохранились в ходе эволюции и идентифицируются, по крайней мере, у беспозвоночных и грызунов.
У дрожжей выделяют две модели старения: хронологическую и репликативную.
Модель хронологического старения применяют к постмитотическим клеткам, продолжительность жизни которых оценивают как период между моментом утраты клеткой способности к делению и ее гибелью. Эту модель обычно применяют к культивируемым в жидкой среде дрожжам, которые прекращают делиться сразу после истощения запасов доступного углерода в среде. Жизнеспособность клеток в данном случае оценивают по их способности возобновлять деление при помещении в свежую среду.
Репликативное старение является моделью старения клеток, активно делящихся митозом, при котором продолжительность жизни материнской клетки определяют по количеству дочерних клеток, отпочковавшихся до ее вхождения в фазу биологического старения. В этом случае для оценки продолжительности жизни из культуры удаляют легко различимые в оптический микроскоп дочерние клетки.
Основной задачей изучения процессов старения является определение природы повреждений, стимулирующих процессы старения и развития ассоциированных с возрастом заболеваний.
В хронологической модели повышение уровня повреждений внутри неделящихся клеток до определенного порогового значения приводит к потере клетками способности к возобновлению деления. При этом в среде культивирования происходит накопление этанола, который конвертируется в токсичную для клеток уксусную кислоту. В репликативной модели причиной старения является ассиметричное распределение повреждений между материнской и дочерней клетками. В процессе деления клетки внехромосомные кольцевые ДНК, окисленные белки цитоплазмы и поврежденные митохондрии выводятся из дочерней клетки и перемещаются в материнскую. Однако, как правило, репликативная продолжительность жизни материнской клетки заканчивается не намного позже, чем прекращает делиться дочерняя. Это указывает на способность здоровой материнской клетки справляться с большей частью ассоциированных с возрастом молекулярных повреждений. Интересно, что при делении очень старых клеток асимметрия деления нарушается и дочерние клетки могут наследовать значительную часть повреждений, вызывающих их преждевременное старение.
Несмотря на ряд отличий, между двумя типами старения дрожжей наблюдается несколько интересных параллелей. Например, выраженное влияние на обе модели старения оказывает доступность питательных веществ. Кроме того, хронологический возраст снижает репликативную продолжительность жизни дрожжевой клетки независимо от количества произведенных ею дочерних клеток.
Хронологическое старение и токсичное действие метаболитов
Обычно при изучении репликационного старения дрожжи культивируют в синтетической среде, содержащей 2% (0,5% или меньше при изучении эффектов низкокалорийной диеты) глюкозы в качестве источника углерода.
Клетки конвертируют глюкозу в этанол, постепенно накапливающийся в среде культивирования. При истощении запасов глюкозы они начинают расщеплять этанол посредством митохондриального дыхания. Формирующиеся при этом активные формы кислорода (АФК) повреждают белки и митохондрии, ускоряя хронологическое старение клеток. Эту гипотезу подтверждают данные, согласно которым воздействия, увеличивающие хронологическую продолжительность жизни дрожжей, одновременно повышают их устойчивость к окислительному стрессу.
Переход клеток на использование этанола в качестве вторичного источника углерода приводит к выделению в культивационную среду уксусной и других органических кислот и, соответственно, повышению кислотности среды. Нейтрализация или удаление кислоты из истощенной среды, также как и перенос клеток в воду, увеличивает продолжительность их жизни, что свидетельствует о влиянии внеклеточных факторов на этот показатель. Перенос постмитотических клеток в воду, содержащую физиологические концентрации уксусной кислоты (но не других кислот) предотвращает увеличение продолжительности жизни. Таким образом, уксусная кислота является фактором, необходимым и достаточным для ускорения хронологического старения дрожжевых клеток. При этом она, согласно существующим данным, не только стимулирует синтез АФК, но и индуцирует сходную с апоптозом гибель клеток. Все это сопоставимо с наблюдениями, согласно которым добавление этанола в культивационную среду укорачивает жизнь дрожжей.Идентификация уксусной кислоты как фактора, лимитирующего хронологическое выживание дрожжей в стандартных условиях, поставила под сомнение целесообразность использования этой модели для изучения старения человека. Однако если уксусная кислота является фактором, специфично ускоряющим хронологическое старение дрожжей, то губительное действие АФК и развивающиеся при этом клеточные реакции вполне могут иметь значение и для других организмов. Кроме того, ряд модификаций, например, подавление активности комплекса киназы мишени рапамицина (target of rapamycin, TOR) или удаление гена рибосомальной S6 киназы, увеличивающих хронологическую продолжительность жизни, увеличивают также и репликативную продолжительность жизни, а также продолжительность жизни беспозвоночных и даже млекопитающих.
В будущем ученым стоит уделить внимание разработке альтернативных условий для модели хронологического старения, которые позволят идентифицировать дополнительные молекулярные факторы, влияющие на выживание неделящихся дрожжевых клеток. Наиболее простым подходом является использование среды-буфера, нейтрализующей токсичное действие уксусной кислоты. Возможно, удаление уксусной кислоты как фактора, лимитирующего выживание клеток, повысит ценность данной модели для изучения старения многоклеточных эукариотов.
Ассиметричное распределение повреждений в процессе репликативного старения
Наиболее детально описанным типом молекулярных повреждений, ассоциированных с репликативным старением, является накопление в материнских клетках внехромосомных кольцевых рибосомальных ДНК, являющихся побочным продуктом рекомбинации рибосомальных ДНК (рДНК). Известно, что белки, модулирующие рекомбинацию рДНК и формирование внехромосомных кольцевых рДНК, влияют и на репликативную продолжительность жизни дрожжей.
Механизм, посредством которого внехромосомные кольцевые рДНК вызывают биологическое старение дрожжевых клеток, неизвестен. Согласно одной из теорий, в стареющих клетках важные факторы репликации или транскрипции вступают в физическое воздействие с внехромосомными кольцевыми рДНК, что лишает их способности выполнять свои нормальные функции. Еще одно возможное объяснение заключается в том, что накопление ДНК, кодирующих рибосомальные РНК (рРНК), сдвигает равновесие между рРНК и рибосомальными белками, что нарушает функционирование хромосом. Последние данные свидетельствуют о том, что избыток кольцевых внехромосомных рДНК может снижать репликативную продолжительность жизни стареющих клеток путем индукции нестабильности рДНК. Получившие эти данные исследователи утверждают, что описанный ими механизм является основной причиной биологического старения клеток, однако эта гипотеза, также как и все остальные, требует убедительных доказательств.
Кроме внехромосомных кольцевых рДНК в материнской клетке ассиметрично накапливаются поврежденные цитоплазматические белки и митохондрии, также способствующие ее репликативному старению. Сегрегация поврежденных цитоплазматических белков в материнской клетке, осуществляемая актиновым скелетом с участием гистоновой деацетилазы Sir2, повышает устойчивость дочерней клетки к окислительному стрессу. Компонент митохондриальной АТФазы Atp2 необходим для преимущественного распределения нормально функционирующих митохондрий в дочернюю клетку. При этом поврежденные митохондрии, снижающие стабильность генома и уменьшающие репликативную продолжительность жизни, перемещаются в материнскую клетку.
Низкокалорийная диета и сохранившиеся в ходе эволюции механизмы долголетия
Низкокалорийная диета является наиболее изученным из факторов, замедляющих старение широкого спектра организмов, начиная от дрожжей и заканчивая млекопитающими. Традиционный протокол снижения калорийности рациона дрожжей заключается в уменьшении концентрации глюкозы в культивационной среде с 2% до 0,5% или ниже, что увеличивает как хронологическую, так и репликативную продолжительность жизни клеток. Ограничение доступности аминокислот также увеличивает репликативную продолжительность жизни дрожжей, однако механизмы этого феномена изучены очень мало. В литературе описано также несколько генетических моделей низкокалорийной диеты, в которых геном дрожжей содержит мутации, снижающие активность киназ, выполняющих функции распознавания питательных веществ, в том числе протеинкиназы А, TOR и Sch9 (рибосомальной S6 киназы дрожжей).
Снижение доступности глюкозы ведет к ряду физиологических сдвигов, влияющих на процессы старения, в том числе метаболический переход с ферментации на митохондриальное дыхание, усиление аутофагии, подавление трансляции информационных РНК и повышение устойчивости к стрессу. Изменение характера метаболизма и устранение поврежденных молекул посредством аутофагии увеличивают хронологическую продолжительность жизни. Механизмы, посредством которых низкокалорийная диета увеличивает репликативную продолжительность жизни, до сих пор остаются предметом споров. Согласно существующим гипотезам, определенную роль в них играют активация Sir2 и ингибирование TOR.
Сиртуины
Белки сиртуины относятся к семейству НАД+-зависимых белковых деацетилаз. Значимость этих белков для процессов старения продемонстрировали результаты экспериментов, согласно которым делеция гена Sir2 уменьшает, а гиперэкспрессия – увеличивает репликативную продолжительность жизни дрожжей. Результаты более поздних работ показали, что активация ортологов гена Sir2 увеличивает продолжительность жизни нематод, мух-дрозофил и мышей. В настоящее время ряд активаторов сиртуинов находится на стадиях разработки и тестирования на моделях различных заболеваний млекопитающих.
Согласно общепринятой гипотезе, Sir2 способствует увеличению продолжительности жизни дрожжей за счет подавления рекомбинации рибосомальных ДНК и, соответственно, формирования внехромосомных кольцевых рДНК. Однако этот механизм не имеет никакого значения для многоклеточных организмов. Этот факт свидетельствует о выполнении сиртуинами других обеспечивающих долголетие функций, не связанных с рДНК. Одной из таких функций, по-видимому, является участие Sir2 в ассиметричном перемещении поврежденных цитоплазматических белков в материнскую клетку (рис. 3).
Экспрессия Sir2 снижается в репликативно стареющих клетках, что сопровождается уменьшением уровня гистонов и их ацетилирования в области теломер. Нарушение функционирование теломер считается причиной старения клеток, поэтому участие Sir2 в поддержании стабильности хроматина теломер потенциально является фактором, способствующим увеличению репликативной продолжительности жизни дрожжей.
Существует достаточно большое количество доказательств того, что сиртуины опосредуют положительное влияние низкокалорийной диеты на состояние здоровья и продолжительность жизни дрожжей, круглых червей и мышей. Однако ученые идентифицировали также несколько независимых от Sir2 механизмов, способствующих продлению жизни дрожжей и нематод в условиях низкокалорийной диеты. В то же время активность SIRT1 является обязательным фактором продления жизни голодающих мышей. Кроме того, существует достаточно большое количество доказательств роли этого белка в регуляции функции митохондрий в условиях дефицита питательных веществ. Очевидно, что сиртуины играют важную роль в регуляции продолжительности жизни организма, однако их роль в запускаемых низкокалорийной диетой механизмах на сегодняшний день не ясна.
Опосредуемый TOR сигнальный механизм и трансляция мРНК
В последние годы ученые уделяют много внимания опосредуемому TOR сигнальному механизму как сохранившемуся в процессе эволюции фактору долголетия и возможному компоненту процессов, запускаемых низкокалорийной диетой. Киназы семейства TOR, идентифицированные у широкого спектра видов живых существ (от дрожжей до человека), регистрируют уровни факторов роста и питательных веществ в организме и в соответствии с этим регулируют его рост, обмен веществ и устойчивость к стрессам. Снижение активности TOR, наблюдаемое в условиях низкокалорийной диеты, продлевает жизнь всем модельных организмам.
Исследования показали, что ингибирование рекомбинации рРНК и трансляции информационных РНК являются ключевыми компонентами опосредуемого TOR сигнального механизма, продлевающего жизнь дрожжам, беспозвоночным и, согласно данным последних работ, мышам (рис. 3).
Существует также гипотеза, согласно которой активация Sir2 происходит при снижении активности опосредуемого TOR сигнального механизма. В основе этого предположения лежит наблюдение, согласно которому ингибирование TOR активирует реагирующие на стресс факторы транскрипции Msn2 и Msn4, которые, в свою очередь, стимулируют экспрессию никотинамидазы Pnc1, снижающей внутриклеточный уровень никотинамида, что может вызывать активацию Sir2. Эта гипотеза выглядит весьма интересной, но на сегодняшний день убедительных доказательств существования взаимосвязи между активностью TOR и Sir2 не существует.
Новые модели работы с дрожжами
Почкующиеся дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются наиболее популярной моделью для изучения механизмов старения, однако эксперименты с другими видами дрожжей также приносят ценные результаты. Наиболее изученной из альтернативных моделей являются делящиеся дрожжи Schizosaccharomyces pombe. Изучение механизмов хронологического старения этого вида дрожжей, а также влияющих на этот процесс факторов, в том числе низкокалорийной диеты и мутаций, модулирующих механизмы распознавания глюкозы, принесло результаты, аналогичные полученным при изучении почкующихся дрожжей. Ученым еще предстоит выяснить, является ли токсичность уксусной кислоты основной причиной преждевременного биологического старения S.pombe. Если это не так, то этот вид дрожжей может оказаться весьма информативной моделью для изучения дополнительных процессов, вызывающих окислительные повреждения и нарушающих работу митохондрий в процессе старения.
В отличие от деления S.cerevisiae, деление S.pombe морфологически симметрично и приводит к формированию двух практически неразличимых сестринских клеток. Однако внимательное наблюдение за многими поколениями клеток позволяет морфологически дифференцировать стареющие материнские клетки и оценивать их репликативную продолжительность жизни. Как и у S.cerevisiae, при делении S.pombe в результате запуска Sir2-зависимого механизма поврежденные белки накапливаются в материнской клетке.
Еще одной интересной моделью являются дрожжи вида Kluyveromyces lactis, расщепляющие глюкозу преимущественно посредством митохондриального дыхания, а не спиртового брожения, как это делают S.cerevisiae. Низкокалорийная диета, заключающаяся в снижении концентрации глюкозы в культивационной среде, не влияет на хронологическую продолжительности жизни этого вида. Таким образом, альтернативные эволюционные стратегии, выбранные S.pombe, K.lactis и другими видами дрожжей, вполне могут предоставить специалистам новые данные о механизмах старения.
Направления будущей работы и перспективы
Результаты изучения механизмов старения дрожжей нельзя недооценить. Некоторые из наиболее перспективных факторов долголетия и потенциальных препаратов для предотвращения старения впервые идентифицированы и охарактеризованы при работе с дрожжами. Способность рапамицина (rapamycin) и ресвератрола (resveratrol) замедлять старение впервые продемонстрирована на дрожжах. Первый препарат, к сожалению, является иммуносупрессором и не пригоден для всеобщего применения, но второй уже проходит клинические исследования в качестве препарата для лечения сахарного диабета 2 типа и, возможно, других ассоциированных с возрастом заболеваний. Важной задачей будущих исследований является отделение аспектов старения, специфичных для дрожжей, от механизмов, выдержавших испытание эволюцией и дошедших до млекопитающих в малоизмененном виде.
Изучение механизмов старения дрожжей не теряет актуальности. В настоящее время эта область продолжает бурно развиваться благодаря появлению новых методов и технологий системной биологии, метаболомики и протеомики. Новые, постоянно совершенствующиеся высокопроизводительные методы оценки продолжительности жизни в ближайшем будущем позволят не только изучить влияние тысяч генетических вариантов на процессы старения, но и провести скрининг малых молекул с целью поиска новых препаратов, предотвращающих старение. Предложенный недавно метод оценки репликативной продолжительности жизни, в основе которого лежит избирательное уничтожение дочерних клеток, а не проводимые под микроскопом микроманипуляции, способен значительно ускорить и облегчить работу с дрожжевыми клетками.
Взаимосвязь между хронологической и репликативной продолжительностью жизни до сих пор остается одним из неизученных аспектов старения дрожжей. Несмотря на то, что уменьшение репликативной продолжительности жизни, вызванное хронологическим старением клеток, продемонстрировано уже более десятилетия назад, лежащие в основе этого феномена механизмы остаются загадкой. Недавно ученые продемонстрировали, что кроме уменьшения репликативной продолжительности жизни хронологическое старение повышает уровень нестабильности генома и ведет к утрате морфологической ассиметричности дочерней и материнской клеток при возобновлении последней митотической активности. Возможно, этот феномен отражает аспект хронологического старения, замаскированный гибелью клеток, индуцируемой уксусной кислотой. Гибридные модели, позволяющие совместить хронологическое и репликативное старение, позволят более детально изучить аспекты старения клеток.
Очень важной задачей будущих исследований является детальное изучение механизмов, посредством которых различные типы молекулярных повреждений приводят к биологическому старению дрожжевых клеток. Как описано выше, как минимум три типа повреждений (внехромосомные кольцевые рДНК, поврежденные цитоплазматические белки и дефектные митохондрии), ассиметрично наследуемых материнской клеткой, ускоряют репликативное старение дрожжей. Очень важно выяснить, каким образом эти повреждения блокируют способность клетки к делению, а также изучить характер их возможных взаимодействий между собой. Детальное изучение этих механизмов, нарушающих функционирование стареющих дрожжевых клеток, поможет разобраться в механизмах старения клеток млекопитающих и, в конечном итоге, человека.
Евгения Рябцева
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru по материалам Nature: Lessons on longevity from budding yeast.
04.05.2010