Подписаться на новости
  • Сенатор
  • ООО "Ай Вао"
  • TechWeek
  • Биомолтекст2020
  • vsh25

Мертвая вода

Как сделана российская инактивированная вакцина от нового коронавируса

Вера Мухина, N+1

В ряду российских вакцин от коронавируса пополнение – Научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов имени Чумакова РАН сообщил, что закончил тесты на животных и уже получил разрешение Минздрава на клинические испытания. Это уже третья российская разработка, после НИЦЭМ им. Гамалеи и «Вектора» допущенная к испытаниям на людях. N+1 поговорил с сотрудниками Центра о вакцине и ее отличиях от других российских разработок.

Многие российские разработчики, в частности «Вектор», Центр им. Гамалеи и BIOCAD, поставили на новые технологии и работают над вакцинами на основе вирусных векторов, ДНК и РНК. В Центре Чумакова пошли традиционным путем – здесь сделали инактивированную вакцину.

Инактивированным вакцинам больше полувека – так что они изучены вдоль и поперек и проверены на разных болезнях. С ними сталкивались все, кто делал прививки от бешенства или энцефалита. Кроме отличной изученности, они могут похвастаться умеренным иммунным ответом и относительной простотой разработки. Российскую вакцину от энцефалита центр Чумакова производит с 80-х годов – это его разработка. Здесь же производят инактивированную вакцину от полиомиелита.

«С нашей [новой] вакциной, – рассказывает Любовь Козловская, заведующая недавно созданным в Центре отделом актуальных и вновь возникающих инфекций с пандемическим потенциалом – всё, думаю, довольно понятно. Было ясно, что нам придётся её разрабатывать на том, что есть. У нас есть готовая платформа для инактивированных вакцин. Когда ты производишь вакцину на существующей платформе, на существующей технологии, можно предполагать, какая у неё будет длительность иммунного ответа, как быстро поднимутся и какими приблизительно будут титры антител, какие будут побочные реакции и как можно их избежать».

Вакцину того же типа, по данным Всемирной организации здравоохранения, делают Китай (сразу несколько, и одна вакцина уже вышла на третью фазу клинических испытаний), Казахстан и Индия.

В чем разница

В случае инактивированных вакцин наша иммунная система учится на «трупах» патогенов – они уже не могут ни размножаться, ни заражать клетки. Помимо безопасности, пассивность этой конструкции служит залогом того, что иммунная система не перевозбудится. При этом она сможет познакомиться с патогеном целиком и самостоятельно подобрать с вирусных «трупов» те детали-антигены, которые ей понравятся – исследователям нет надобности подбирать их специально и создавать синтетические конструкции (как это приходится делать создателям вакцин нового поколения, к которым относятся и разработка Центра им. Гамалеи, и новосибирского «Вектора»).

С теми же характеристиками – цельностью вириона и его пассивностью – связаны, впрочем, и недостатки инактивированных вакцин. Они привлекают внимание иммунитета – и особенно Т-клеток – хуже деятельных векторных и аттенуированных вакцин, и потому его память оказывается короче. Поэтому приходится стимулировать его при помощи дополнительных раздражителей и чаще прививаться. Эта же слабость есть и у белковых вакцин.

Кроме того, чтобы получить коронавирусные «трупы» для вакцины, исследователям для начала нужно размножить сам вирус. Работать с патогенными штаммами не всегда удобно и повышает требования к безопасности.

Схема производства инактивированной вакцины выглядит просто. Надо наработать достаточное количество вируса, обезвредить его, очистить, добавить «усилители» – и после этого уже можно колоть полученный препарат пациентам. Тем не менее, в этом деле полно нюансов. Даже имея значительный опыт за плечами, создать инактивированную вакцину от коронавируса оказалось нетривиальной задачей, признают в беседе с N+1 разработчики.

«В нашем случае главной проблемой был просто сам новый вирус, – говорит Любовь Козловская. – Нет никаких регламентирующих вещей: какой вирус, какой штамм надо брать. Вирус появился за три месяца до того, как мы начали разрабатывать [вакцину]. Было непонятно, сможет ли он расти на тех клетках, которые мы используем? Не придется ли нам заново всё [линию клеток, параметры роста] отрабатывать?»

Кроме того, продолжает она, в центре не было штамма коронавируса. Ученым пришлось выделять его из проб пациентов, секвенировать, выяснять – подойдет ли он на роль вакцинного штамма, похож ли он на те, которые циркулируют хотя бы в России. К счастью, проблем с клеточной линией не возникло и для роста вирусу вполне подошла стандартная.

Как обезвредить вирус

После того как ученые получили посевной материал, инициатива перешла к отделу разработки, который занялся технологией производства вакцины.

Чтобы получить достаточное количество вирусов для вакцины их необходимо размножить. Самостоятельно, они это сделать не могут, так что для этого их подсаживают к культурам клеток. Те заражаются, синтезируют в огромных количествах вирус и потом погибают, а вирусы идут на производство вакцины.

В том или ином виде этот этап есть в производстве любых вакцин на основе вирусов. Для векторных вакцин нужно размножить основу, например, аденовирус, а в случае инактивированных или аттенуированных вакцин разработчики имеют дело с самим патогеном. Но на разных производствах процесс сильно отличается в зависимости от вируса, целей и технической оснащенности.

Опасность вируса играет важную роль: за основу для векторов берется довольно безобидный вирус, а в центре Чумакова работают с настоящим SARS-CoV-2, который по российским метрикам относится ко второму классу патогенности. В частности это означает, что в лаборатории должно быть деление на инфекционную и неинфекционную зоны, повышенные требования к вентиляции и изоляции помещений, дополнительные СИЗ и особые правила поведения для сотрудников.

Впрочем, отмечают исследователи, с активными вирионами сотрудники контактируют только на самых ранних этапах производства, когда происходит первичный посев вируса.

Это делается вручную, а потом полученной смесью без непосредственного контакта засевают биореактор – агрегат с большой одноразовой емкостью, заполненной питательной средой и шариками-микроносителями. Питательная среда нужна для клеток Vero, которые растут на шариках и служат фабриками по размножению вируса. Биореакторы с микроносителями это довольно новая технология, благодаря которой получается увеличить площадь поверхности, на которой растут клетки, и обеспечить им равномерный pH, температуру, доступ кислорода, и питательных веществ.

 

chumakov1.jpgПеред тем, как заражать клетки, их надо самих размножить. Для этого подходит биореактор-«качалка»: в одноразовом пакете в питательной среде растут клетки, платформа под ним качается и перемешивает содержимое пакета, а система мониторинга следит за условиями внутри и по трубкам передает всё необходимое. По мере накопления биомассы их пересаживают в другие, более крупные реакторы. Всего этот процесс занимает несколько дней. Снимки предоставлены Центром им. Чумакова.

Вопреки опасениям ученых вирус хорошо размножался на стандартной линии клеток Vero и ничего нового тут изобретать не пришлось. После того как клетки подрастут, их заражают и ждут еще 3-4 суток, а затем смесь обезвреживается, не покидая биореактора. Обычно это делается нагреванием или формальдегидом, но в центре Чумакова используют более прогрессивный бета-пропиолактон. Нагревание может изменить конформацию белков вируса и тем самым изменить их до неузнаваемости для нашей иммунной системы, тогда как бета-пропиолактон просто запирает навечно нуклеиновые кислоты внутри вириона. По сравнению с формальдегидом (который тоже воздействует в основном на нуклеиновые кислоты), с бета-пропиолактоном работать быстрее и приятнее: он инактивирует вирус всего за сутки (против двух недель для формальдегида) и нейтрализуется потом простым нагревом до 37 градусов Цельсия.

chumakov2.jpg

При помощи таких систем исследователи концентрируют вирусосодержащую жидкость для дальнейшей очистки. Это тоже происходит без непосредственного человеческого контакта с вирусом.

После этого вирионы отправляют на фильтрацию и хроматографические очистки, а одноразовую емкость уничтожают. Дополнительно проверяют то, насколько хорошо сработал бета-пропиолактон: обливают полученным раствором клетки и смотрят, заразили ли их инактивированные вирусы.

Кроме вируса, в вакцину добавили стандартный адъювант – гидроокись алюминия. Сами по себе «мертвые» вирусы не способны привлечь внимание иммунной системы, и адъювант им в этом помогает: он собирает их на себе и стимулирует их поедание иммунными клетками.

Проверка

Регламент доклинических и клинических испытаний подробно прописан, но даже внутри него у исследователей остается определенная свобода действий.

«Самый творческий подход можно проявлять как раз при проверке иммуногенности, – говорит Козловская. – Вы можете взять тех животных, которые, как вы считаете, вам лучше подойдут. Все, что регламентировано, – это то, что их должно быть два вида. В нашем случае это были мыши и обезьяны-мармозетки. С ними немножко проще работать, чем с большими [приматами]. У нас есть своя колония, и это облегчает задачу. Ну, и приматы значительно ближе к человеку, чем любая мышь».

Первым делом нужно было отработать дозу и схему вакцинации – на это и ушла большая часть мышей. Эффективность выбранной дозы исследователи подтвердили на мышах другого гаплотипа и только после этого принялись за дорогие и сложные эксперименты на мармозетках – маленьких нечеловекообразных обезьянках родом из Нового Света.

После подбора иммуногенной дозы вакцину проверили на безопасность: посмотрели общую токсичность, способность вызывать жар и аллергию как сразу, так и спустя некоторое время. Тут всё по протоколу: аллергенность принято смотреть на кроликах, а хроническую токсичность – на морских свинках.

И как, работает?

Во всех тестах исследователи сравнивали вакцинированных животных с контрольными, которым вместо рабочего препарата кололи плацебо. По словам Анастасии Пиняевой, руководительницы отдела разработки и внедрения инновационных и полупромышленных технологий, побочных эффектов в тестовой группе и контрольной группах не нашлось, но при этом у тестовых животных появлялись антитела к S-белку коронавируса в «достаточных» с точки зрения исследователей титрах.

Сравнить эту «достаточность» пока что невозможно: данные испытаний Центр им. Чумакова не опубликовал, равно как «Вектор» и Центр им. Гамалеи (хотя оба они уже перешли от экспериментов с животными к людям).

Как обычно смотрят иммунный ответ
Иммунный ответ в экспериментах с животными смотрят практически так же, как и у испытуемых людей на первых стадиях клинических испытаний: по титрам антител и Т-клеточному ответу.
Проверять эффективность вакцины, заражая животных вирусом, в данном случае бессмысленно, – многие из них совсем не болеют COVID-19 и в целом это не входит в стандартный комплекс доклинических исследований.
В России создают линии мышей, чувствительные к SARS-CoV-2, а некоторые ученые проводят тесты на сирийских хомячках. Но хорошо отработанной модели для подобных проверок пока нет.

Кроме того, исследователи подчеркивают, что из-за самой новизны и малой изученности инфекции не совсем понятно, «сколько надо антител, когда они будут нейтрализоваться, как долго они должны держаться».

Но для того чтобы наверняка получить устойчивый иммунитет они – как и многие другие разработчики – решили подстегнуть иммунную систему повторной, «бустерной» прививкой. «Ввиду того, что это всё-таки пандемия, и нам нужно как можно быстрее достичь максимальных титров, которых мы можем достичь... мы решили, что это [будет] двукратная вакцинация с двухнедельным интервалом. Опять же, чтобы это просто было быстрее» – рассказывает Любовь Козловская. При такой схеме, уже спустя месяц после первой вакцинации антитела выходят на плато с титрами больше, чем 1 на сотню.

Инактивированные вакцины нацелены на антительный ответ, а Т-клеточный ответ обычно минимальный. Это связано с тем, что инактивированные вирионы не заражают клетки и из-за этого не могут быть представленными Т-лимфоцитам должным образом. Тем не менее, предварительные результаты экспериментов на мышах говорят о том, что у животных всё-таки формируется пул Т-клеток, которые при повторной встрече с антигеном начинают усиленно делиться. Это значит, что вакцина может включать не только антительный, но и клеточный иммунный ответ.

Что дальше?

Часть животных будут наблюдать еще в течение некоторого времени, но в целом доклинические испытания завершены. Ученые приступают к тестам на людях.

В самых первых испытаниях безопасности планируется привить всего 15 человек. В течение пары недель за ними будут наблюдать в стационаре и если за это время не всплывет каких-то серьезных побочных эффектов, то ученые приступят к расширенным испытаниям. Всего в них примет участие двести человек, из которых 150 получат вакцину, а 50 – плацебо. Оценивать будут стандартные параметры: побочные эффекты, титры антител и Т-клеточный ответ, причем это будет двойное слепое исследование, – пациенты и врачи из лабораторий на местах не будут знать, кому какой вариант вакцины достался.

По итогам испытаний планируется получить временное регистрационное удостоверение и приступить в 2021 году к третьей фазе КИ. На вопрос, будут ли кого-нибудь прививать на основании временной регистрации вне клинических испытаний, в центре Чумакова ответили, что не исключают возможности производства вакцины не для клинических исследований.

На всех хватит?

По сравнению с другими разрабатываемыми вакцинами, инактивированные требуют большего надзора в плане безопасности. Это может сказаться на цене и доступности вакцины и стать препятствием для расширения производства: не всякое помещение подходит для работы с SARS-CoV-2 и не любая компания имеет для этого оборудование и разрешение.

В центре Чумакова планируют справляться своими силами. У них есть собственное отлаженное производство, на котором, в частности, работают с вирусами того же класса патогенности – с тем же вирусом клещевого энцефалита. Его мощностей – по словам исследователей – должно ориентировочно хватить на десять миллионов доз коронавирусной вакцины в год, а при необходимости их можно расширить, поставив дополнительные биореакторы.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru


Читать статьи по темам:

вирус вакцина разработка препаратов Версия для печати
Ошибка в тексте?
Выдели ее и нажми ctrl + enter
назад

Читать также:

Первых нет и отстающих

Насколько лидеры гонки за вакциной от COVID-19 опережают конкурентов и сколько будет стоить прививка в разных странах?

читать

Новая глобальная гонка

Международная гонка за создание вакцины от коронавируса напоминает состязание между СССР и США за освоение космоса в 1960-е годы.

читать

Кто следующий?

Благодаря еще одной РНК-вакцине у мышей и обезьян выработалось множество антител, которые могут бороться с возбудителем COVID-19.

читать

Обезьян привили от коронавируса

В ответ на повторное заражение в организме макак не развилась иммунная реакция, благодаря чему ученые уже начали испытания на добровольцах.

читать

Вакцины от COVID: кто, где, когда

Эпидемия не прекратится, пока большая часть из нас не переболеет или пока не появится вакцина от коронавируса. Но почему же ее до сих пор нет?

читать