Как белок Cas9 «узнаёт» нужный участок ДНК
Разгадана главная загадка иммунной системы бактерий
NanoNewsNet по материалам Berkeley Lab: Puzzling Question in Bacterial Immune System Answered
Ученые получили ответ на главный вопрос о белке, играющем значительную роль в иммунной системе бактерий и быстро становящемся ценным инструментом генной инженерии. Группа исследователей из Национальной лаборатории Лоуренса в Беркли (Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley Lab) и Калифорнийского университета в Беркли (University of California, Berkeley) установила, как бактериальный фермент Cas9, направляемый РНК, идентифицирует и разрушает чужеродную ДНК при вирусных инфекциях, а также вызывает сайт-специфические генетические изменения в животных и растительных клетках. Как выяснили ученые, способность Cas9 редактировать геном реализуется благодаря присутствию коротких последовательностей ДНК, известных как PAM (protospacer adjacent motif).
«Наше исследование раскрывает две основные функции мотива PAM, которые объясняют, почему он так важен для реализации способности Cas9 выбирать своей мишенью и расщеплять последовательности ДНК, комплементарные направляющей его РНК», – говорит руководитель исследования биохимик Дженнифер Дудна (Jennifer Doudna), PhD. «Присутствие РАМ, примыкающего к сайтам-мишеням в чужеродной ДНК, и ее отсутствие у этих мишеней в геноме организма-хозяина позволяет Cas9 точно различать «не свою» ДНК, которая должна быть разрушена, и «свою» ДНК, которая может быть практически идентичной. Кроме того, присутствие PAM необходимо для активации фермента Cas9».
Короткая последовательность ДНК (тринуклеотид), известная как PAM (показана желтым цветом),
позволяют бактериальному ферменту Cas9 выявлять и разрушать чужеродную ДНК, а также
вызывать сайт-специфические генетические изменения в животных и растительных клетках.
Присутствие PAM требуется и для активации Cas9. (Рис. KC Roeyer)
С созданием генно-инженерных микроорганизмов, таких как бактерии и грибы, играющих все возрастающую роль в производстве методами зеленой химии ценных продуктов, включая терапевтические препараты, биотопливо и биоразлагаемые пластмассы, фермент Cas9 становится важным инструментом редактирования генома в руках специалистов-практиков в области синтетической биологии.
«Понимание того, как Cas9 находит в геноме, состоящем из миллионов и миллиардов пар оснований, специфические состоящие из 20 пар оснований последовательности-мишени, позволит улучшить таргетинг генов и редактирование генома бактерий и других типов клеток», – продолжает доктор Дудна. Доктор Дудна совмещает работу в отделении физических бионаук (Physical Biosciences Division) Лаборатории Беркли с преподаванием на кафедрах молекулярной и клеточной биологии и химии Калифорнийского университета в Беркли, а также является научным сотрудником Медицинского института Говарда Хьюза (Howard Hughes Medical Institute).
Бактерии противостоят никогда не прекращающемуся натиску со стороны вирусов и инвазивных фрагментов нуклеиновой кислоты, известных как плазмиды. Чтобы выжить, микробы используют адаптивную основанную на нуклеиновых кислотах иммунную систему, вращающуюся вокруг генетического элемента, известного как CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). Благодаря сочетанию CRISPRs и РНК-направляемых эндонуклеаз, таких как Cas9 (Cas – CRISPR-associated), бактерии могут использовать небольшие специализированные молекулы crRNA (или CRISPR РНК), чтобы таргетировать и расщеплять комплементарные им последовательности ДНК при вторжении вирусов и плазмид и предотвращать их репликацию. Существуют три различных типа иммунных систем CRISPR-Cas. Доктор Дудна и ее группа сосредоточили свое внимание на системе типа II, которая в расщеплении по целевым сайтам двухцепочечной ДНК основывается исключительно на РНК-программируемом Cas9.
«Что всегда было одной из основных головоломок в области CRISPR-Cas, это то, как Cas9 и аналогичные РНК-направляемые комплексы обнаруживают и узнают комплементарные им ДНК-мишени в контексте всего генома – классическая проблема иголки в стоге сена», – говорит Самуэль Штернберг(Samuel Sternberg), PhD, ведущий автор статьи об исследовании, опубликованной в журнале Nature (DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9). «Все ученые, разрабатывающие РНК-программируемый Cas9 для генной инженерии, полагаются на его способность к таргетингу уникальных внутриклеточных последовательностей длиной в 20 пар оснований. Однако, если бы Cas9 просто слепо связывал ДНК в случайных местах генома до столкновения со своей мишенью, процесс был бы невероятно времязатратным и, наверно, слишком неэффективным, чтобы обеспечить иммунную защиту бактерии или использоваться в качестве инструмента в генной инженерии. Наше исследование показывает, что Cas9 ограничивает свой поиск, находя в первую очередь PAM-последовательности. Это повышает скорость нахождения мишени и сводит к минимуму время, затрачиваемое на перепроверку нецелевых сайтов ДНК».
Для визуализации отдельных молекул Cas9 в реальном времени в процессе их поиска и «исследования» ДНК ученые использовали уникальный метод анализа ДНК – так называемый метод ДНК-штор (DNA curtains technology) – и флуоресцентную микроскопию полного внутреннего отражения (total internal reflection fluorescence microscopy, TIRFM).
Метод ДНК-штор позволяет достичь беспрецедентного понимания механизма поиска ферментом Cas9 своей мишени.
«Мы установили, что Cas9 перепроверяет ДНК на предмет нахождения соответствующей последовательности с помощью образования РНК-ДНК пар оснований только после узнавания РАМ, что позволяет избежать случайного таргетинга комплементарных сайтов собственного генома бактерии», – продолжает доктор Штернберг. «Однако, даже если Cas9 каким-то образом ошибочно свяжется с комплементарной последовательностью собственного генома бактерии, его каталитическая нуклеазная активность не включится без присутствия PAM. С помощью этого механизма оценки ДНК PAM обеспечивает два резервных пропускных пункта, гарантирующих, что Cas9 не сможет ошибочно уничтожить ДНК собственного генома бактерии».
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru
04.02.2014