История геномики. Часть 2: ДНК-технологии

Александр Панчин, м.н.с. Института проблем передачи информации им. А.А. Харкевича РАН, аспирант факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ.

В первой части статьи рассказано, как появились первые методы чтения генетических последовательностей, в чем они заключались и как геномика двигалась от чтения отдельных генов к чтению полных геномов, в том числе полных геномов конкретных людей.

Прежде чем рассказать историю появления новых методов секвенирования хочется рассказать о нескольких необычайных технологиях, связанных с ДНК, которые появились совсем недавно в пике развития геномики. На рис. 1 показаны изображения, полученные путем самосборки ДНК. Таких картинок в пробирке может быть миллионы, и они образуются сами при правильном подборе условий [1]. Эти работы появились в 2006 г. и получили название «ДНК-оригами», в более общем виде – «ДНК-нанотехнологии».

Рис. 1. Снимки упорядоченных структур, составленных из молекул ДНК, под электронным микроскопом

Но для развития геномики ключевую роль играет другой тип технологий – технологии секвенирования (чтения) геномов. Мы уже разобрали метод Гилберта-Максама 1973 г., следующий за ним метод терминации цепи Сенгера 1975 г. и улучшенный Худом метод Сенгера 1985 г., который позволил создать первые автоматические секвенаторы. Как показала история проекта «Геном человека», эти методы по-прежнему были очень дорогостоящие и медленные – секвенирование первого генома человека стоило более 3 миллиардов долларов и заняло 13 лет. В начале XXI века был достигнут предел секвенаторов, терминирующих цепь: в одном капилляре можно по цене $1 прочитать 1000 нуклеотидов за 1 час, в одной машине – до 100 капилляров. Цена в 1 доллар на самом деле минимальная – в России те же 1000 «букв» читают за $15-20.

Сегодня появляются все новые и более совершенные методы секвенирования, которые можно разбить на две группы. Старые методы основаны на всевозможных изощренных способах получения большого количества одинаковых молекул ДНК на определенном носителе, для усиления сигнала при чтении молекулы ДНК. Самые поздние методы основаны на разработке сверхточных приборов, способных анализировать одиночные молекулы.

Прежде чем рассказывать о первом типе приборов, необходимо разобрать так называемую полимеразную цепную реакцию (ПЦР), которая позволяет размножить одну-единственную молекулу ДНК до миллиона или даже миллиарда копий. Технология была разработана в 1984-1986 годах Кэри Муллис [2]. При высокой температуре (порядка 95 градусов) молекула ДНК денатурирует: превращается из двухцепочечной молекулы в две одноцепочечные. При более низкой температуре (обычно это 40-60 градусов) к одноцепочечной молекуле ДНК может присоединится короткий фрагмент – праймер, который по своей последовательности комплементарен приблизительно 20 нуклеотидам длинной молекулы ДНК. При температуре около 72 градусов специальный фермент – ДНК-полимераза, выделенная из бактерий, живущих в горячих источниках, может достроить одноцепочечную молекулу ДНК, к которой присоединился праймер, до двухцепочечной. Если мы знаем последовательность 20 нуклеотидов в левой части крупной молекулы ДНК и в правой ее части, то мы можем, используя два праймера (слева и справа), с экспоненциально возрастающей скоростью размножить фрагмент ДНК. Для этого надо циклически нагревать смесь реагентов до 95 градусов (денатурация), охлаждать до 60 (отжиг праймеров), нагревать до 72 (достраивание цепи) и снова денатурировать (температура указана приблизительно и зависит от конкретных праймеров и полимеразы). Схематично это изображено на рис. 2. Удивительно, но для успешной реакции ПЦР теоретически достаточно иметь одну-единственную молекулу «матрицы», то есть можно взять ДНК из одной клетки и размножить любой фрагмент ее ДНК в любое количество раз.

Рис. 2. Три цикла полимеразной цепной реакции. Темно-красным и темно-зеленым показаны праймеры.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР):



Рис. 3. Технология 454. Используются шарики размером 44нм, на которых размножаются молекулы ДНК.

В том же 2005 г.  лабораторией Джорджа Черча [4] был предложен другой метод с использованием точно таких же шариков, только меньшего размера. Такие шарики, размером с микрон и хранящие на себе множество идентичных копий молекулы ДНК прилепляют к специальному стеклышку. Далее добавляют смесь праймеров вида XNNNNNNNN, где N – любой нуклеотид, а X – известный нуклеотид, к которому прикреплена молекула красителя определенного цвета (4 цвета на каждую «букву»). Не вдаваясь в детали, скажем лишь, что по тому, какого цвета праймеры прилипают к каждому шарику, мы узнаем, какой нуклеотид находится на этом шарике. Праймеры вида XNNNNNNNN указывают первую «букву», NXNNNNNNN – вторую и так далее. Цена примерно в 9 раз меньше, чем цена секвенирования по Сенгеру.

Третий оригинальный метод чтения ДНК предложен компанией Illumina в 2005 г.  и реализован в виде платформы Solexa [5] на пути к плану «$1000 долларов – один геном». Молекула ДНК разрезается, и к ней пришиваются с обеих сторон два разных адаптера. На специальное стеклышко приклеиваются точно такие же адаптеры, которые служат праймерами. Молекул ДНК берется мало, и они прилипают в случайном месте стеклышка, после чего добавляют ферменты, необходимые для ПЦР. Поскольку все праймеры прилеплены к стеклышку, то новые копии молекулы ДНК будут образовываться рядом. Так вокруг каждой исходной молекулы ДНК вырастает целый «лес» (рис. 4) одинаковых молекул, и таких кластеров образуются миллионы. Далее добавляют свободно плавающие праймеры и меченые флуоресцентными красителями разных цветов терминирующие нуклеотиды всех четырех типов – так к каждой молекуле ДНК присоединится праймер и только 1 нуклеотид, цвет которого можно определить с помощью лазера. Затем нуклеотид химически модифицируют, чтобы к нему мог прилипнуть следующий терминирующий нуклеотид, и так далее.

Рис. 4. Illumina Solexa - кластеры ДНК.

Но уже через несколько лет после появления этих секвенаторов многое успело измениться. Современные детекторы способны регистрировать сигналы, полученные от отдельных молекул, что сняло задачу усиления сигнала путем амплификации ДНК (как это делали, используя Solexa или 454). Начиная с 2008 г. на вопрос «как читают последовательность молекулы ДНК?» можно ответить: «берем молекулу и читаем». Компания Helicos разработала секвенатор нового поколения [6]. По новому методу ДНК режется на части, и к одному из концов фрагмента прикрепляют длинную последовательность из молекул аденина («букв А») с помощью специального фермента, а в конце ставят светящуюся метку. На специальном стеклышке приклеены молекулы ДНК, состоящие из множества «букв T». Когда образец выливают на стеклышко, то молекулы ДНК прилипают участками, содержащими нуклеотиды «А», к прикрепленным к стеклышку нуклеотидам «T» по принципу комплементарности. Далее специальный микроскоп сканирует стеклышко и по свечению метки находит положение каждого прилипшего отрезка молекулы ДНК (рис. 5). Метку отмывают и добавляют по очереди каждый из четырех типов нуклеотидов с меткой. Снова смотрят свечение молекул, снова отмывают метку и присоединяют следующий нуклеотид. Специальный компьютер записывает положение миллионов вспышек после каждой реакции. Такая система позволяет читать миллиарды нуклеотидов в день.

Рис. 5. Технология Helicos. Каждая светящаяся точка – отдельный нуклеотид!



Секвенирование с помощью Helicos.

Но и это, оказалось, не предел. В 2009 г.  появляется революционно новый метод чтения ДНК с использованием того же инструмента, который использует клетка при делении – ДНК-полимеразы, фермента, который удваивает ДНК. Прибор, разработанный в лаборатории Стивена Тернера [7], действительно уникален. На дно специальных ячеек, расположенных на прозрачном стекле, прикрепляются одиночные молекулы ДНК-полимеразы (рис. 6). Область ничтожного размера прямо вокруг закрепленного фермента просвечивается с помощью специального лазера. В ячейку добавляют нуклеотиды всех четырех типов, помеченные разными светящимися маркерами. Область, которую анализирует лазер, столь мала, что молекула в норме не задерживается в ней долго, уплывает и не оставляет сигнала. Если же во время удвоения ДНК молекула удерживается полимеразой, то молекула задерживается в сканируемой области и оставляет сигнал. После присоединения нуклеотида светящаяся метка отваливается и уплывает. Таким образом, скорость чтения у такого прибора становится равной скорости работы полимеразы.

Рис. 6. Технология SMART Pacific Biosciences – чтение одиночных молекул во время их происоединения к нарастающей цепи ДНК с помощью ДНК-полимеразы.

Видео Pacific Biosciences можно посмотреть на сайте компании.

Таким образом, за последние 10 лет произошел переворот в возможности чтения геномов. Цена секвенирования тысячи нуклеотидов упала с менее $1 по методу Сенгера в 1990-х до 5 центов с технологией 454 в 2005, затем в том же году до 0,2 цента с технологией Illumina и, наконец, 0.05 цента – с технологией Helicos. Цена чтения ДНК с самыми последними секвенаторами компаний Complete Genomics и Pacific Biosciences, которые, вероятно появятся на рынке в этом и следующем году, еще неизвестна, но прогнозы весьма оптимистичны.

Возникает вопрос: а что дала и сможет дать людям геномика? Ответ прост: очень много.

Прочитанные геномы дают основу для построения эволюционных деревьев, что поможет разобраться в том, как именно шла эволюция живых организмов на нашей планете. Когда стоимость чтения геномов животных приблизится к порогу $1000 за геном, станет возможным прочитать геномы всех живых организмов, исследовать любые родственные взаимоотношения между любыми группами живых организмов и разработать новую систематику.

Во-вторых, мы узнаём все больше и больше о роли наших генов. Благодаря сравнению генома человека и человекообразных обезьян мы узнали, что не количество генов делает нас отличными от остальных животных, а их качество, особенности. Сравнивая геномы разных животных, мы можем узнать, за что отвечает каждый из генов, а может быть – даже улучшить тот или иной ген, чтобы вывести новый, более приспособленный организм. Генетические данные активно используются при создании медицинских препаратов или новых сельскохозяйственных культур. 
Последние исследования по изучению одиночных мутаций в генах показывают связь между определенными генетическими вариациями и различными заболеваниями и особенности тела и психики человека. Так существуют гены, определяющие то, станем ли мы лысеть, какой у нас цвет глаз, рост, насколько нам грозит диабет или определенная форма рака, есть ли у нас предрасположенность к спорту, полезно ли для нас принятие кофе, алкоголя или аспирина. С 2007 года стали появляться компании, такие как 23AndMe (их генетическая диагностика за $399 – лучшее изобретение 2008 года по регтингу журнала Time), Navigenics или DecodeMe, которые используют так называемые ДНК-чипы для определения генетических характеристик подобного рода. Возможность читать целые геномы многократно улучшит предсказательные способности таких проектов, надежность, детализированность и точность предсказаний, адекватность рекомендаций (рис. 7).

Рис. 7. Наши знания о человеке в «догеномную эру»

Рис. 8. Наши знания о человеке в начале эпохи геномики

Сегодня мы еще не умеем изменять гены взрослых людей, но можем предотвратить многие генетические заболевания, если будем знать причину и заблаговременно начнем профилактику или лечение. Так, исследования гена, связанного с прогрессирующей формой миопатии, процессов при его прочтении в клетке, позволили разработать лекарства, спасающие тех, кто в противном случае был бы обречен. Изучение функций генов открывает дорогу персональной фармакогеномике – индивидуальному подходу к лечению. Людей с разными генами следует лечить по-разному: кому-то поможет одно лекарство, кому-то другое, и это важно знать.

Безусловно, такие возможности породят новые социальные, этические и философские проблемы. Медицинские страховые компании могут захотеть информацию о геноме клиентов, чтобы решить, выгодно ли им дать страховку – сделать им скидку для человека, который генетически обещает быть здоровым или заставить потенциального больного платить за страховку больше? Правильно ли это? Не следует ли спортсменам соревноваться в разных категориях по аллеям генов, связанных с физической подготовкой, так же как боксеры легкого веса не дерутся с тяжеловесами? Можно ли использовать генетическую информацию, чтобы отдать предпочтение тому или иному сотруднику компании в повышении или устройстве на работу? В США подобная дискриминация уже запрещена, однако армия США проводит свои генетические анализы. Уже сегодня знания о возможных опасных для здоровья генах помогают выбирать самых здоровых зародышей при экстракорпоральном оплодотворении, но можно ли менять гены будущих людей в зиготе (сперматозоиде или яйцеклетке) или в оплодотворенной яйцеклетке?

В любом случае, как показывает история последних десятилетий, развитие этих технологий неизбежно, как неизбежно то, что когда-нибудь они станут доступны (если не обязательны) для всех. Нам же остается готовиться к грядущим переменам и участвовать в них.

Литература:

1. Rothemund PW: Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature 2006, 440(7082):297-302.
2. Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H: Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1986, 51 Pt 1:263-273.
3. Margulies M, Egholm M, Altman WE, Attiya S, Bader JS, Bemben LA, Berka J, Braverman MS, Chen YJ, Chen Z et al: Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 2005, 437(7057):376-380.
4. Shendure J, Porreca GJ, Reppas NB, Lin X, McCutcheon JP, Rosenbaum AM, Wang MD, Zhang K, Mitra RD, Church GM: Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome. Science 2005, 309(5741):1728-1732.
5. Bennett ST, Barnes C, Cox A, Davies L, Brown C: Toward the 1,000 dollars human genome. Pharmacogenomics 2005, 6(4):373-382.
6. Harris TD, Buzby PR, Babcock H, Beer E, Bowers J, Braslavsky I, Causey M, Colonell J, Dimeo J, Efcavitch JW et al: Single-molecule DNA sequencing of a viral genome. Science 2008, 320(5872):106-109.
7. Eid J, Fehr A, Gray J, Luong K, Lyle J, Otto G, Peluso P, Rank D, Baybayan P, Bettman B et al: Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules. Science 2009, 323(5910):133-138.

Портал «Вечная молодость» www.vechnayamolodost.ru
16.09.2009